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核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳

PAGE胶的配制(DNA电泳用)50ml体系:
丙烯酰胺有效分离
(bp)
丙烯酰
胺30%
(ml)
10×TBE
(ml)
ddH2O
(ml)
TEMED
(µl)
过硫酸铵
10%(µl)
3.5% 100-1000 5.83 5 39.17 25.0 250 5.0% 100-500 8.33 5 36.67 25.0 250 8.0% 60-400 13.33 5 31.67 25.0 250 12.0% 40-200 20.0 5 25.00 25.0 250 15.0% 25-150 25.0 5 20.00 25.0 250 20.0% 5-100 33.33 5 11.67 25.0 250 5ml体系:
丙烯酰胺丙烯酰胺
30%(ml)
10×TBE
(ml)
ddH2O
(µl)
TEMED
(µl)
过硫酸铵
10%(µl)
3.5% 0.583 0.5 3.917 2.5 25
5.0% 0.833 0.5 3.667 2.5 25
8.0% 1.333 0.5 3.167 2.5 25 12.0% 2.00 0.5 2.5 2.5 25 15.0% 2.50 0.5 2.0 2.5 25 20.0% 3.333 0.5 1.167 2.5 25
1、丙烯酰胺30%为29:1(质量比,丙烯酰胺:双甲叉丙烯酰胺)
2、TEMED 可以加到1ul/ml。

不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围表
丙烯酰胺(%) 有效分离范围(bp) 溴酚兰* 二甲苯青*
3.5 100~2000 100 460
5.0 80~500 65 260
8.0 60~400 45 160
12.0 40~200 30 70
15.0 25~150 15 60
20.0 10~100 12 45
*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp). 凝胶的制备过程:
1、按要求装配好垂直电泳板,两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边,防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。

2、将装好的玻璃电泳板倾斜成45~60℃角。

3、按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数。

4、加入TEMED后,立即混匀,缓缓倒入两玻璃板间的胶床中,直到液体接近溢出时为止。

5、立即插入适当的梳子,密切注意防止梳齿下产生气泡,用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上,然后将玻璃板斜靠在物体上,使成10°角,可减少液体泄漏的机会。

6、室温聚合一小时后,将玻璃板插入电泳槽中,上紧,倒入0.1XTBE缓冲液。

7、小心取出梳子,加样。

预电泳:
1.对于预电泳,有一种解释是为了除去没有聚合完全的丙烯酰胺分子和交联剂,其实最直接的理解就是预电泳会让胶跑的好看一点。

2.电压根据胶的长度来,是5~10V/cm,100V以下。

3.在预冷装置下电泳,防止局部温度高。

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