有目的有选择的把目的片段切开
B. 连接酶类
将目的片段和载体相连
C. 其他工具酶
修饰, 加工等作用
建筑精选课件
4
限制性内切酶II及其产生的3种不同末端
5'突出的粘性末端 EcoR I
3'突出的粘性末端 Pst I
平末端
P
P P
P P
EcoR V
建筑精选课件
5
P
同切酶和同粘酶
同切酶: 识别相同的位点, 但生成不同的末端.
8
连接酶及其对底物的要求:
T4 Ligase, Ecoli Ligase
底物:
自由5’末端和自由3’末端, 5’末端带磷 酸基团 反应条件：Mg++，ATP存在
建筑精选课件
9
其它工具酶
聚合酶(polymerase): DNA聚合酶I, klenow片段, Taq, Pfu,
末端转移酶
外切核酸酶(exonuclease): exo III, S1核酸酶, DNase I
29
建探针标记
标记物： 同位素标记：32P 非放射性标记：荧光标记，生物素，dig(地高辛）等
建筑精选课件
32
模板DNA
变性
随机6核苷酸引物， dNTP, 某种标记dNTP
DNA Pol I
5‘
随机引物 标记的DNA片段
达
建筑精选课件
14
lacZ
建筑精选课件
15
建筑精选课件
16
建筑精选课件
17
建筑精选课件
18
建筑精选课件
19
建筑精选课件
20
如何提高克隆效率?
提高插入片段和载体的比例 尽可能采用粘端连接* 载体脱磷以降低载体自连 插入片段磷酸化 改进转化条件
建筑精选课件
21
问题:
有一外源片段用某种酶切,生成了5´ 突出粘性 末端 5´ -GATC, 但是载体上的单酶切位点 只能生成下面这几种粘性末端:
脱磷酸酶(dephosphatase): 碱性磷酸酯酶CIP
磷酸化酶,激酶(kinase)
逆转录酶(reverse transcriptase)
RNase H, RNase A
甲基化酶(methylase)
建筑精选课件
10
载体及其构成基本要素
能独立复制并稳定传代:复制起始点ori或自主复制序列ARS和着丝 粒, 端粒
建筑精选课件
12
宿主
•繁殖快, 易于培养, 能够快速得到产物 •对所携带基因的表达产物具有较高耐受性, 具有 克隆最多种基因的可能 •突变率低, 能够稳定忠实的保存被克隆基因
建筑精选课件
13
常用宿主
大肠杆菌: 繁殖快, 易培养, 易分离产物 噬菌体: 转化效率高, 易于保存 酵母: 繁殖最快的真核生物, 适于有蛋白质加工的基因表
GAL4-AD
建筑精选课件
39
Bait DNA
PCR技术及其应用
应用范围：
检测和诊断（高灵敏度） 基因克隆（eg: 通过部分已知序列扩增未知目标片段
建筑精选课件
40
建筑精选课件
41
建筑精选课件
42
建筑精选课件
43
建筑精选课件
44
建筑精选课件
45
其他常用分子生物学技术
丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE） 脉冲电泳 双向电泳 Southern杂交 northern杂交 western杂交
方便插入外源片段: 单酶切位点 选择标记: 药物抗性 报告基因: 插入筛选标记
易分离提取 高产率（多拷贝） 强启动子 多宿主
建筑精选课件
11
常用载体
质粒(plasmid)，粘粒(cosmid)，噬菌体，噬粒 (phagemid), 病毒，PAC，YAC，BAC
特殊用途的载体
表达型载体， 分泌型载体，穿梭载体
同粘酶: 识别不同的位点, 但产生相同的粘性末端
建筑精选课件
6
同切酶
Sma I
5´ ... C C C^G G G ... 3´ 3´ ... G G G^C C C ... 5´
Xma I
5´ ... C ^ C CG G G ... 3´ 3´ ... G G GC C ^ C ... 5´
建筑精选课件
7
同粘酶
BamH I
5´ ... G^G A T C C ... 3´
3´ ... C C T A G^G ... 5´
Bgl II
5´ ... A^G A T C T ... 3´
3´ ... T C T A G^A ... 5´
Sau3A
5´ ... ^G A T C ... 3´
3´ ... C T A G^ .建..筑精5选´课件
5´-CTAG 5´-TCGA 5´-TTAA 应当采用怎样的策略来提高连接效率?
建筑精选课件
22
不依赖于内切酶和连接酶的体外重组
----位点专一性重组
（依赖于短片段同源序列的重组）
cosN, LoxP
建筑精选课件
23
cre LoxP LoxP
LoxP
建筑精选课件
LoxP
24
Transform
第十四章 遗传工程
利用转基因手段对生物进行 人为改造的技术
建筑精选课件
1
什么是遗传工程？
体外DNA重组技术：利用工具酶将 外源片段和载体连接，导入生物体并 使其稳定复制和传代的技术
建筑精选课件
2
目的
研究工作 生物产品(生物反应器) 改良物种(提高品质) 基因治疗
建筑精选课件
3
工具酶
A. 剪切酶类
建筑精选课件
33
建筑精选课件
34
建筑精选课件
35
REMOVE
bait DNA lacZ
建筑精选课件
REMOVE Inserted DNA coding Protein for detection
GAL4-AD
38
bait DNA lacZ
Bait DNA
Inserted DNA coding Protein for detection
+report gene substrates
建筑精选课件
25
建筑精选课件
26
建筑精选课件
27
新鲜组织研磨或匀浆
rRNA tRNA mRNA
RNA提取液
总RNA
AAAAAAAA
过oligo(dU)柱
TTTTTTTTT AAAAAAAA
洗脱
AAAAAAAA
建筑精选课m件 RNA
28

建筑精选课件
建筑精选课件
46
转基因动植物和基因治疗
转基因动物：医学研究，生物制药 转基因植物：改良品质，提高抗逆能力 基因治疗：治疗药物无法根治的遗传性疾病
建筑精选课件
47
5´ C A U G 3´ mRNA 3´ G U A C 5´ Antisense RNA
建筑精选课件
48
建筑精选课件
49