d、离心后 EP 管中液体分三层，提取中间无色 液相，移入新的 EP 管中。可-80℃保存。 4、蛋白浓度测定。 a、配工作液：溶液 A：溶液 B=50：1（200ul： 4ul）。
需测试复孔。标本 X，则需 A 量=2*（X+1+1） *200；B=2*（X+1+1）*4。
WT LOS T
c、复孔，取蛋白 6ul 加入 0.6mlEP 管，再加入 54ulH2O，混匀。即 10 倍稀释。 d、取 20-25ul 10 倍稀释蛋白样本加入 96 孔板平 底板内，再加入 200ulAB 工作液，混匀振荡后， 37℃ incubate 30min。 注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加 蛋白后需换 tip，再加入工作液即起反应，应缩 短时间。 e、酶标仪检测 562nm 吸光度。Program f、计算蛋白浓度。 根据标准曲线，如 Y=1.2745X-0.1684 其中 Y： 蛋白浓度；X：吸光度。
ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25
ug/ml,15.625 ug/ml 八个浓度的蛋白标准溶液。
3.M231 用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。
Байду номын сангаас
4.各取 20ul 蛋白标准品和待测 M231 样品至
相应标记的微孔板中。
5.滴加 200ulBCA 工作液至每孔混匀并充分
震荡 30S
6.停止震荡，在 37 度孵育样品 30min
7.在酶标仪中测量 562nm 时的吸光值。
8.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的
蛋白浓度。
三、实验结果
1 2 34 5 6 7
Com
msie 0.5 0.5 0.4 0.2 0.10.04 0.0
法吸 3 22 31 62 18 1 01
最终蛋白浓度为：10*Y（ug/ul、 mg/ml） g、蛋白样本放-80℃冻存。
大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在 典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶 液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或
酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比 较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种 都有其独特的优点。如果样品数量较多，可以同 时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一 种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的 化学组成和检测的蛋白量。
3、抽蛋白（应冰上进行）： a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状） 加入裂解液中。一般 10ml 管体系中加入：7-8 粒 磁 珠 、 100mg 组 织 、 1mlRIPA+10ulPMSF 、 1 tablet Cocktail。 b、匀浆。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再 将剩余的 1/3 匀浆介质或生理盐水冲洗残留在 烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆， 左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器 皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研 磨数十次（6～8 分钟），充分研碎，使组织匀浆 化。 机器匀浆：用组织捣碎机 10000～15000r/min 上 下研磨制成 10％组织匀浆，也可用内切式组织
匀浆机制备（匀浆时间 10 秒/次，间隙 30 秒， 连续 3～5 次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织 等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用 Soniprep150 型超声波发生器以振幅 14 微米超 声处理 30 秒使细胞破碎，也可用国产超声波发 生仪，用 40 安培，5 秒/次，间隙 10 秒反复 3～ 5 次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方 法匀浆，也可以反复冻溶 3 次左右（即让细胞加 适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶 解，再结冰，再溶解，反复 3 次左右），但有部 分酶活力会受影响。 c、将组织匀浆转入 1.5ml 的 EP 管中（eppendorf 管、离心管）。12000r/min 4°C 离心 15min。
Commassie 法（Bradford 法）： 原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料 G-250 结合，颜色从棕色变为蓝色，在 595nm 处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出 待测蛋白的浓度。 BCA 法： 原理：在碱性条件下，蛋白将 Cu++还原为 Cu+，Cu+与 BCA 试剂形成紫色络合物，测定 其在 562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比， 即可计算待测蛋白的浓度。 现对这两种方法进行比较： 一、实验材料： 细胞总蛋白提取试剂盒（AR0103） M231 BCA 蛋白定量试剂盒（AR0146）
Commassie 改良增强型蛋白质定量试剂盒 （AR0145）
二、操作步骤： Commassie 法： 1.将 BSA 冻干标准品（10mg/支）用生理盐水 或 PBS 稀释成 2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml 八个浓度的蛋白标准溶液。 2.M231 用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。 3.各取 20ul 蛋白标准品和待测 M231 样品至 相应标记的微孔板中。 4.滴加 200ul 考马斯增强型试剂（溶液 A）至 每孔混匀并充分震荡 30S 5.停止震荡，在室温孵育样品 10min 6.在酶标仪中测量 595nm 时的吸光值。 7.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的 蛋白浓度。 BCA 法： 1.按 50 体积 BCA 试剂 A 加入 1 倍体积 BCA 试剂 B 配置适量 BCA 工作液，充分混匀。 2.将 BSA 冻干标准品（10mg/支）用生理盐 水或 PBS 稀释成 2000ug/ml，1000 ug/ml,500
动物固体组织蛋白提取 -Protocol
动物固体组织蛋白提取 Protocol
1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入 75%乙醇中 浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也 可放入烤箱中，速度较快。
2、 裂解液配制：RIPA：PMSF=100：1，现配 现用。（1000ulRIPA+10ulPMSF）。置入 4℃冰 上。