1.组织块迅速置于预冷的生理盐水中，洗去表面的血迹，将组织称量后切成较小的组织块（0.2-1.0g），放入组织匀浆器中，按组织100mg：提取试剂体积1ml的比例加入相应体积的蛋白提取试剂（需提前加入酶抑制剂）进行匀浆，至组织研磨完全。

2.超声处理（同细胞蛋白样品的制备），处理完后置冰上裂解4-5小时。

3.10000 g/min离心10min，取中层溶液，加入等体积的蛋白上样缓冲液（2X），或1/4体积蛋白上样缓冲液（5x）（AR1112）,置100℃水浴箱沸水浴中变性5分钟。

1、动物肝脏直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次。

2、称量约40mg研磨组织，加入200 ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟。

3、10,000×g 离心15分钟。

4、收集上清，进行下一步的实验。

手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。

反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。

①吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，细胞刮刮脱细胞，收集至离心管，1000rpm离心5分钟。

洗涤后的细胞转移至洁净EP管，②冰上操作，配制细胞裂解液，1ml Lysis,Buffer
中加入10 μl磷酸酶抑制剂、1 μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF。

混匀后冰上保存数分钟待用。

③在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液。

200μl移液器反复吹打，至蛋白析出。

④4℃摇床，温和振摇15分钟。

⑤14000rpm，4℃离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物。

⑥BCA法测蛋白浓度。

蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。

提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。

细胞提取步骤
1. 冰上操作，向细胞沉淀中加入200ul细胞裂解液，2μl 100mM的PMSF。

2. 200μl移液器反复吹打，至溶液变得粘稠。

3. 4℃摇床，温和振摇30min。

4. 15000rpm，4℃离心15min，上清即为细胞全蛋白提取物
5. 蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。

注意：提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。