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冰冻切片的制作
• 取材和固定： 灌注后立即切取组织块，并 快速投入固定液中，或者处死后直接冷冻。
• 脱水和透明：梯度蔗糖 • 包埋：OCT，3%聚乙烯醇。 • 切片制作：切片 • 贴片：直接贴 • 固定：冰冻丙酮3-5分 • 保存：-20°C
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灌注
0.5%戊巴比妥钠100mg/Kg麻醉小鼠，5分 钟左右小鼠麻醉好，仰卧位固定四肢，用 酒精棉球擦胸腹部毛，前开皮肤暴露胸部 肌肉层，剑突上成V型剪开胸廓，暴露心脏， 剪掉右心耳（即视野下心脏上色暗红组 织），与心尖处30°角刺入左心室，37° 左右生理盐水约10ml缓慢注入，冲净血液 止，换4%多聚甲醛溶液（4°预冷），1020分钟，鼠僵硬为好。
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脱水和透明，浸蜡
• 石蜡切片：75%，80%，85%，90%，95%（2 个），无水乙醇（2）中每个4小时-过夜， 正丁醇1-2天。二甲苯（2个）20-30分钟。 三个蜡，每个大于2小时。
• 冰冻切片：固定后脱水用10%20%30%蔗糖 （0.1MPBS溶）每个室温下4小时——过夜， OCT包埋，先在锡纸盒冻一层，在中间放组 织，切面朝下，再用OCT将组织没过，尽量 减少气泡，在液氮表面，保持小盒水平， 待中心尚透明时取出，放于-80°C保存。
小鼠脑组织病理实验总结
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内容
• 石蜡切片的制作 • 冰冻切片的制作 • 免疫组化 • 免疫荧光 • HE • 病理相关试剂配制 • 注意事项
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精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
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切片
• 石蜡：冷水——温水（54°-56°）——
烤片（80°）
切好烤片后可以室温保存 。
• 冰冻：切片温度-18°—-20°
直接贴Βιβλιοθήκη 分后-20°切好于冰冻丙酮中固定5
保存。
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固定方法注意事项
1.组织块大小2cmx2cmx0.5cm 2.组织标本应及时放入固定液中,切忌干涸 3.组织固定后必须冲洗,除去多余的固定液 4.一般固定剂温度以室温,某些病毒则须低温
—冷却至室温
—再修复一次冷却
—PBS5分×3
—2020/1擦1/13 片加一抗，4°过夜
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—第二日PBS5分×3
—加二抗 室温20分
—PBS5分×3
—DAB显色
—水冲5-10分
—苏木素1-3分
—水冲10-15分
—80%85%90%每个3分
—95%（2个）无水乙醇（2个）二甲苯（2个 ）每个5分
—中性树胶封片。
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固定
• 4%多聚甲醛根据不同实验需求要求石蜡切 片的固定时间不同，几小时到一周。
• 我曾用过2天，可以。 • 冲水，固定的时间越长冲水时间越长，预
防甲醛沉积。
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取脑
断头，剪开皮肤拨向两侧暴露颅骨，从 枕骨大孔处沿正中线剪开露骨，用镊子掰 开露骨，暴露脑组织，用弯头镊将脑组织 勾出，在坐标纸上根据小鼠脑图谱取相应 脑区组织，厚3mm左右。
20-30分，加入g氧化汞煮沸2分钟，
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注意事项
• 安全 • 解剖位置 • 液体配制 • 染色时间 • 原因查找
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免疫荧光
—PBS5分×3
—5%BSA室温封闭1小时
—加一抗，4°过夜或根据说明书时间
—第二日PBS5分×3
—加二抗37°孵育1小时
—PBS5分×3
—DAPI染色
—PBS2分
—丙三醇封片荧光显微镜下观察照相。
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HE
—70°烤片一夜 —二甲苯3个每个10分钟无水乙醇，95%，90%
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• 阻断液：0.3% H2O2 甲醇溶液。30%双氧水 2ml加入甲醇定容至200ml。（现用现配）
• 修复液：（400ml） 柠檬酸0.16g 柠檬酸钠1.18g
• 苏木素： • 100g硫酸铝钾加热溶于1250ml水中 • 5g苏木素精粉末溶于100ml无水乙醇中 • 溶解后硫酸铝钾稍凉，加入醇溶苏木素煮沸
温度及孵育时间 5.每张切片应表明抗体名称,防止相互混淆
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实验过程
—70°考片一夜
—二甲苯3个每个10分钟无水乙醇，95%，90%，85 ，80%每个10分钟
—3%双氧水阻断室温10分钟（现配现用）
—抗体修复液（现配，400ml一次一个抗体盒）
微波炉高火6-7分
• 4%多聚甲醛：40g多聚甲醛粉末溶于500ml 水（50°左右）黄枪头加一滴1M氢氧化钠 至澄清，冷却至室温，与500ml0.2MPBS混 合，滤纸过滤。
• 0.2MPB:1000ml 0.2M磷酸氢二钠810ml称57.996g
0.2M磷酸二氢钠190ml称5.928g
• 蔗糖：用0.1MPBS配制 • 生理盐水：0.85%氯化钠溶液
笨，没有学问无颜见爹娘 ……” • “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
石蜡切片的制作
• 取材和固定： 处死动物后或者灌注后立即 切取组织块，并快速投入固定液中。
• 脱水和透明：梯度酒精和二甲苯 • 浸蜡和包埋：石蜡 • 切片制作：切片 • 贴片：捞片，展片 • 保存：烤片
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下处理,用丙酮-20度至-40度固定30分钟 5.浓度采用10%中性甲醛或4%多聚甲醛 6. 固定液量是标本体积20倍 7.固定时间不超过24小时
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组化实验设计
1.对常规组织切片进行仔细观察,根据可提供 形态学特点,选择最佳并能反映病变的组织 标本
2.列出免疫组化的指标 3.进行预实验(设立阳性、阴性对照) 4.找出抗体的最佳修复方法、稀释度、孵育
，85%，80%每个5分钟 —苏木素1-5分 —水 —盐酸酒精 —水 —0.5%氨水
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—水 —95%酒精2分 —0.5%醇溶伊红1秒 —95%酒精30秒 —95%酒精，无水乙醇（3个）每个2分 —二甲苯（2个）每个2分钟 —中性树胶封片，吹干
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病理相关试剂配制