…CG
(7) GT…
(8)AATTC…
CA…
G…
你能用DNA连接酶将它们连接起来？
2和7能连接形成…ACGT… …TGCA…；
4和8能连接形成…GAATTC… …CTTAAG…；
相同点
形成磷酸二酯键
限制性内切酶与解旋酶的区别
限制酶
解旋酶
区别
切割特定的核苷酸序列 的磷酸二酯键
将DNA两条链的氢键 打开形成两条单链
据右图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是（ D
）
A. 限制性内切酶可以切断a处，DNA连接酶可以连接 a处 B. DNA连接酶可以连接a处 C. 解旋酶可以使b处解开 D. 连接b处的酶可以为DNA连接酶
实质 结果
基因拼接技术或DN拼接 → 导入 → 表达
基因重组 人类需要的生物类型和生物产品
1.1 DNA重组技术的基本工具
3
DNA重组技术的基本工具
工欲善其事, 必先利其器.
想一想:获得转基因抗虫棉需要做哪些工作呢? 实现这一精确的操作过程的工具是什么呢?
3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输记车”一记
（1）载体的作用
将外源基因转移到受体细胞中去。 运载体对外源基因进行大量复制。
（2）作为载体必须具备的条件
能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。 具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 具有某些标记基因，便于进行筛选。 必需是安全的，不会对受体 细胞有害。 大小应适合，便于提取和操作
• 黏性末端
当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切 开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切 口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正 好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
EcoRI限制酶的切割：
大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC
序列，并在G和A之间切开。
在G与A
中轴线
之间切割
黏性末端
黏性末端
A
磷
5
酸
4
1
3
2
二
酯
T
5
键
4
1
3
2
7
限制酶所识别的序列有什么特点？ 限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个
碱基，都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧 的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
图1-1 限制酶识别序列的中心轴线
当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
(1)来源: 主要从原核生物 (2)化学本质： 蛋白质
识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并 (3)作用 且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸
二酯键断开。
特异性，即识别特定的脱氧核苷酸序列,切割 (4)作用特点：特定位点。
(5)切割方式 错位切：产生两个相同的黏性末端 平切：形成平末端
专题1 基因工程
一、基因工程的概念
指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外 DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性， 从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
由因于此基又因 叫工 做程DN是A重在组DN技A分术子。水平上进行设计和施记工一的记，
基因工程的别名
操作环境 操作对象 操作水平 基本过程
要切两个切点，产生四个黏性末端，两个。
• 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会 怎样呢？
会产生相同的黏性末端。
• 是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成 重组的DNA分子了?
实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。
2、ＤＮＡ连接酶——“分子缝合针”
种类：
E·coli DNA连接酶（黏性末端） T4 DNA连接酶 （黏性末端和平末端）
作用部位： 是磷酸二酯键，不是氢键。
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸 之间的磷酸二酯键 ,这样一个重组的DNA分子就形成了。
E·coliDNA连接酶与T4DNA连接酶比较：
类型
来源
相同点
功能 差别
E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复 只能连接黏性末端
磷酸
T4DNA连接酶
（3）常用的载体
质粒 λ噬菌体衍生物 动植物病毒
常用的载体：质粒
有标记基因的 存在，可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别
质粒存在于许多细菌 以及酵母菌等生物细 胞中。是一种裸露的、 结构简单、独立于细 菌拟核DNA或细胞核 之外自我复制的很小 的双链环状DNA分子
有切割位点
复制起始的 一段序列
不属于质粒被选为基因运载体的理由是
• DNA连接酶与DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA连接酶
区别1
1)只能将单个核苷酸连 1)在两个DNA片段之 接到已有的核酸片段上，间形成磷酸二酯键
形成磷酸二酯键
2)以一条DNA链为模板，2)将DNA双链上的两 区别2 将单个核苷酸通过磷酸 个缺口同时连接起来，
二酯键连接成一条互补 不需要模板 的DNA链
平末端
当限制酶从识别序列的中心轴线处切
开时，切开的DNA两条单链的切口，是平
整的，这样的切口叫平末端。
SmaI限制酶的切割：
只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。 中轴线
CCCGGG GGGCCC
思考题：
• 要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切点？可 产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？
A、能复制
（ D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
议一议
1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？ 双链DNA
2、能否用SARS病毒作为基因载体？ 不能
3、作为载体，若没有切割位点将怎样？
不能进行DNA的重
4、携带目的组基因的载体是否进入了受体细胞，
如何鉴定？
载体上应有标记基因
5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制， 将怎样？
可能造成基因丢失
思考与探究
1.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限 制酶切割形成的DNA片段：
(1) …CTGCA (2) …AC
(3) GC…
…G （4）…G
…TG (5) G…
CG… (6) …GC
…CTTAA ACGTC…
T4噬菌体 二酯键
能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
D记N一A聚记合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？
连接DNA链
DNA连接酶
双链
DNA聚合酶
单链
连接部位
将单个核苷酸加
在两DNA片段之间形 到已存在的核酸
成磷酸二酯键
片段的3’末端的
羟基上，形成磷
酸二酯键
相同点
都能形成磷酸二酯键 二者都由蛋白质构成