酶动力学综合实验实验（一）——碱性磷酸酶Km值的测定【目的要求】1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响2.了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km值的方法。
【实验原理】1、碱性磷酸酶：碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。
其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。
但它不是单一的酶，而是一组同功酶。
本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。
2、米氏方程：Michaelis-Menten 在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：错误！未找到引用源。
(1) 式中：v表示酶促反应速度，错误！未找到引用源。
表示酶促反应最大速度，[S]表示底物浓度，错误！未找到引用源。
表示米氏常数。
3、错误！未找到引用源。
值的测定主要采用图解法，有以下四种：①双曲线作图法（图1-1，a）根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2错误！未找到引用源。
时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。
这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。
实测错误！未找到引用源。
一个近似值，因而1/2错误！未找到引用源。
不精确。
此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。
②Lineweaver- Burk作图法双倒数作图法（图1-1，b）实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。
其中之一即取（1）式的倒数，变换为Lineweaver- Burk方程式：错误！未找到引用源。
(2)以错误！未找到引用源。
对错误！未找到引用源。
作图，即为y=ax+b形式。
此时斜率为错误！未找到引用源。
，纵截距为错误！未找到引用源。
把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为—错误！未找到引用源。
③Hofstee作图法（略）把（2）式等号两边乘以错误！未找到引用源。
，得：错误！未找到引用源。
(3)以v对错误！未找到引用源。
作图，这时斜率为错误！未找到引用源。
，纵截距为错误！未找到引用源。
，横截距为错误！未找到引用源。
④Hanas作图法（略）把（2）式等号两边乘以[S],得：错误！未找到引用源。
(4)以对[s]作图，这时斜率为错误！未找到引用源。
，纵截距为错误！未找到引用源。
（a）(b)本实验主要以双倒数法，即Lineweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。
具体原理如下：本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下（PH10.0，和60℃），准确反应13分钟。
在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长620nm比色。
在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。
反应式如下：然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以光密度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。
【仪器与试剂】仪器：1.恒温水浴2.721型分光光度计试剂：1．酚试剂：称钨酸钠（错误！未找到引用源。
W错误！未找到引用源。
·2错误！未找到引用源。
O）100g，钼酸钠（错误！未找到引用源。
Mo错误！未找到引用源。
·2错误！未找到引用源。
O）25g置1500mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。
充分混匀，使其溶解。
小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。
在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。
冷却后定容至1000mL，过滤即成，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。
置棕瓶中，可在冰箱长期保存。
若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。
使用时用蒸馏水稀释一倍，最后酸度为1N。
2．2.5mM磷酸苯二钠基质液：称取625mg磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2•2H2O），溶于1,000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置冰箱内可保存一年之久。
3．碱性缓冲液（pH10.0）：称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000ml.4．碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶1mg,加水3~4ml，冰箱内可保存五周左右。
【实验步骤】取6支试管按下表加入试剂：1 2 3 4 5 60.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 2.5mM磷酸苯二钠（ml）蒸馏水（ml）0.8 0.6 0.4 0.2 - 0.1 碱性缓冲液1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0（ml）混匀后，60℃欲温5分钟0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 -碱性磷酸酶液（ml）混匀后，60℃水浴13分钟（准确计时）注意：1）加入碱性磷酸酶液要快速、准确。
用移液枪加2）此时为酶促反应，总体积2.1ml3）第六管不加酶。
酚试剂（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 10%Na2CO3(ml3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0)混匀后，室温放置15分钟注意：1）酚试剂为显色剂，同时为酶的变性剂，故加入酚试剂后酶促反应即停止。
2）Na2CO3 提供碱性环境，加入Na2CO3 后试剂才显色以6管为调零点，在620nm波长处比色。
【结果处理】1 将各管光密度和底物浓度记入下表管号O.D 1/O.D [S] 1/[S]123452以1/O.D为纵坐标，1/[s]为横坐标，按Lineweaver- Burk作图，求出碱性磷酸酶的Km值。
【注意事项】1）加入碱性磷酸酶的量要准确2）保温时间要准确准确保温的方法：从第一管加入酶液开始计时，每隔1分钟向下一只试管加酶液,直至加完，到准确13分钟立即向第一管加酚试剂，以终止其反应，并每隔1分钟向下一只试管加酚试剂,直至加完止，这样保证每管准确保温13分钟。
【思考题】1）Km 的意义及其影响因子2）为什么酶促反应速度以初速度表示3）为什么O.D可直接代替V作图4）分析自己的实验数据实验（二）——温度对酶活性的影响【实验目的】了解温度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。
【实验原理】每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。
一般而言，若酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久丧失；而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分的恢复其活性。
【仪器与试剂】仪器：1．冰箱 2.恒温水浴锅 3.试管和试管架4．吸量管及吸量管架 5.移液枪及枪头 6.胶头滴管7．烧杯试剂：1．PH6.8的缓冲液：量取15.45ml的0.2M磷酸氢二钠和4.55ml的柠檬酸混合摇匀即可。
2．0.5%淀粉的0.5%氯化钠溶液：0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化钠，溶于100ml 蒸馏水（需加热）。
3．0．03175g/L碘液4．1M HCl溶液 5.1M NaOH溶液 6.稀释100倍的唾液7.冰水浴【实验步骤】1．制管和预温由于本实验对恒温反应要求较高，故每个温度梯度使用两支试管，分别标记为A 管和B 管，同时欲温底物与酶。
A 管加入PH6.8的缓冲液和0.5%淀粉液；B 管使用移液枪加入稀释100倍的唾液，相对应的两支试管置于设定的温度下预温5min 。
取12支洁净试管，参照下表加入试剂：*6号管为对照组（比色时作为0号管），置于室温，且淀粉液用蒸馏水代替2．混合A 、B 管将1号A 管试剂迅速加入温度对应的B 管中(为了最大限度保证酶的量)，此时为计时的起点（使用秒表），摇匀后放回对应温度继续水浴。
注意：转移A 管试剂前需将其摇匀。
3．时间控制然后每隔1min 或2min （时间自定）按上步操作依次把2、3、4、5、6号的A 、B 管混合 ，严格控制好时间。
4．中止反应准确反应13min ，向1号管加入2滴1M HCl 溶液，立即混匀，中止反应，按上一步的顺序和时间间隔依次对各管进行操作，并移至试管架。
后再各用2滴1M NaOH 溶液中和每管。
5．显色在每管中各加入2ml 0.03175g/L 碘液并混匀，观察现象。
6．比色若不同温度梯度间现象差别不明显，则进行比色，通过光密度值来比较。
【结果处理】记录现象（或比较吸光度值），做出合理分析。
【注意事项】严格注意时间的控制及各物质的添加量。
【思考题】 如果某同学（没有严格按照教案步骤）做出的实验结果为唾液淀粉酶的最适温度为70度，请分析他得出这样的结果的可能原因。
管号 1（0℃） 2（室温） 3（37℃） 4（50℃） 5（70℃） 6（室温） A PH6.8的缓冲液（ml ） 2 2 2 2 2 2 含NaCl的0.5%淀粉液（ml ） 2 2 2 2 2 用2ml的蒸馏水代替B 稀释100倍的唾液（ml ）1 1 1 1 1 1实验（三）——PH对酶活性的影响【实验目的】了解PH对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。
【实验原理】1.PH对酶活性影响的机理：PH影响酶活性中心的某些必须基团的解离,而这些基团往往仅在某一解离状态时才最容易同底物结合或具有最大催化活性；PH影响可解离基团的底物和辅酶的荷电状态,从而影响酶对他们的亲和力；PH还可以影响酶活性中心的空间构象,从而影响酶的活性。
2.本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受PH的影响的情况。
淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解,从而得到各种糊精乃至麦芽糖,少量葡萄糖等水解产物。
碘液与淀粉及其不同程度的水解产物反应呈现不同颜色,即淀粉(蓝色)、紫色糊精(紫色)、红色糊精(红色)、麦芽糖及少量葡萄糖(黄色)。
【仪器与试剂】仪器：1、冰箱2、电炉3、恒温水浴锅4、试管架及试管5、移液管架及移液管试剂：1、0.2M磷酸氢二钠溶液：称取35.61g含2个结晶水的磷酸氢二钠，用水定容至1L。
2、0.1M柠檬酸溶液：称取21.01g含一个结晶水的柠檬酸，用水定容至1L。
3、唾液淀粉酶：将唾液分别稀释10倍、50倍和100倍，得三种不同浓度的酶液、4、0.5%淀粉的0.5%氯化钠溶液：0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化钠，溶于100ml 蒸馏水（需加热）。
5、0.1%淀粉液：0.1g可溶性淀粉，加到100ml蒸馏水中，加热溶解。
6、碘液：15g碘化钾和12.7g碘，加少许水使碘完全溶解后，再用水稀释至200ml。
7、1%氯化钠溶液。
8、0.1%硫酸铜溶液。
【实验步骤】（一）PH对酶活性的影响1、缓冲溶液的配制取六只洁净的三角烧瓶，按表1编号和加试剂：表1 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制取六支洁净试管，编号后按表2操作：表2 pH对酶活性的影响【结果处理】记录现象（或比较吸光度值），做出合理分析。