19
20
聚乙二醇（PEG）诱导法的优缺点
• 优点：此法比病毒更易制备，活性稳定， 融合成本低，无需特殊设备，融合率较高； 融合过程没有种间、属间、科间的特异性 或专一性。
• 缺点：聚乙二醇诱导细胞融合的有效浓度 （50%~55%）对细胞毒性很大，融合率较 低及经验性大等缺陷。
21
三、物理法
• 电脉冲诱导细胞融合技术 • 激光融合技术 • 空间细胞融合技术 • 离子束细胞融合技术 • 非对称细胞融合技术
• 1965年，英国Harris等成功的运用灭活的 病毒作为促融剂诱导细胞融合，并且产生 的杂交细胞可以存活。
10
仙台病毒（HVJ）诱导法
一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞 膜上，并使两细胞相互凝聚；
• 在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需 要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0-8.2；
28
5、非对称细胞融合技术
• 非对称细胞融合技术，是利用某种外界因素(常为γ射线， 即γ融合)辐照某一细胞原生质体，选择性地破坏其细胞 核，并用碘乙酰胺碱性蕊香红6G处理在细胞核中含有优良 基因的第2种原生质体，选择性地使其细胞质失活。然后 融合来自这2个原生质体品系的细胞，从而实现所需胞质 和细胞核基因的优化组合。
• 或者使前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入 到后者原生质体的染色体内，实现有限基因的转移，从而 在保留亲本之一全部优良性状的同时改良其某个不良性状。
29
第三节 细胞融合技术的应用
30
一、微生物细胞融合技术的应用
• 微生物细胞融合技术一方面用于生物药品 的生产，包括抗生素、生物活性物质、疫 苗等；另一方面为发酵工业提供优良菌种， 如酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交，分离 子后代中个别菌株具有糖化和发酵的双重 能力。
31
二、植物细胞融合技术的应用
• 基础理论研究 • 培育抗性植株 • 培育新型植株 • 应用于种质保存和有用物质生产
32
1、培育抗性植株
• Shelley用马铃薯二倍体作亲本经过体细胞 杂交得到抗科罗拉多马铃薯甲虫的四倍体 体细胞杂种；
• Bastia等对耐霜冻的野生种和栽培种进行 体细胞杂交，获得的所有体细胞杂种都比 栽培种亲本耐霜冻，其中有3株比野生种亲 本的耐性还高。
• 细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP； • 融合成巨大细胞，仍需ATP 。
11
病毒促使细胞融合的主要步骤如下
1. 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近； 2. 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜
间互相渗透，胞质互相渗透； 3. 两个原生质体或细胞的细胞核互相融合，两个细胞
24
电融合法示意图
25
2、激光诱导法
• 利用激光的光镊建立细胞间接触．激光微束可以 对相邻细胞的接触区细胞进行破坏，从而诱导许 多细胞中所需的2个相邻细胞融合。
– 优点：与前面几种方法相比，最突出的优点在于它的 高度选择性，可选择任意2个细胞进行融合，易于实现 特异性细胞融合，作用于细胞的应力小，定时、定位 性强，损伤小，参数易于控制，操作方便，可利用监 控器清晰地观察整个融合过程，实验重复性好，无菌， 无毒。
– 缺点：此法只能逐一处理细胞，不能像其他方法一样 同时处理大量细胞。
26
3、空间细胞融合技术
• 背景：由于地球引力的存在，有液泡的原生质体 与无液泡的原生质体的密度差加大，异源细胞间 的融合得率十分有限。在利用动物细胞融合生产 单克隆抗体过程中，由于无法排除地球引力的影 响，要提高淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相 当困难。
细胞融合
1
第一节 细胞融合概述
2
一、细胞融合的定义
• 细胞融合(cell fusion)就是指在外力（诱导剂或促融剂）作用下， 两个或两个以上的异源（种、属间）细胞或原生质体相互接触， 从而发生膜融合、胞质融合和核融合，并形成杂种细胞的现象， 也称细胞杂交（cell hybridization）。
14
二、化学法
• 盐类融合法：此法是应用最早的诱导原生 质体融合的方法，对原生质体的破坏小。
• 高钙和高PH值融合法：
– Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。 Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱 导融合成功并获得l00余株体细胞杂种。提高该 方法的使用范围是亟待解决的问题。
• 这种手段打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的 界限，扩大了遗传物质重组的范围。
• 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系 统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体 DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。
6
第二节 细胞融合常用的方法
7
按促融剂的不同分为
• 生物法 • 化学法 • 物理法
• 在空间的微重力环境下，细胞融合得率明显增加， 主要是降低了重力沉淀影响。
27
4、离子束细胞融合技术
• 原理：在离子束与生物体相互作用中，粒子的植入、 动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀，引起 细胞膜透性和跨膜电场的改变。据此原理，发展了离 子束诱导细胞融合技术。
• 由于用于辐照的离子束的参数除了能量可调外，离子 种类、电荷、质量皆可调，因此，离子束的可操纵性 强，可以用微束对细胞进行超微加工，有目的地切割 染色体用于基因工程和细胞工程，通过消除部分染色 体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的。
15
• 聚乙二醇（PEG）融合法：1974年华裔加拿 大籍科学家高国楠(Kao)发现PEG可促进不 同科属的植物原生质体之间的融合．当加 入一定分子量的PEG时，融合效率较病毒诱 导法提高1000倍以上。
16
聚乙二醇诱导法（PEG）
• 聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH， 分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。
产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 • 20世纪80年代出现了电融合技术。
5
三、细胞融合的意义
• 理论上说，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新 的生物资源，这对于种质资源的开发和利用具有深远的 意义。
• 细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合， 使远源杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力 手段。
程； 免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。
23
电融合的基本步骤
• 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶 液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不 是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极 化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列 成串。
• 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频 直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个 紧密接触的细胞融合在一起。
融为一体； 4. 进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体
的杂种细胞。
12
用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 13
病毒法的一些缺点
• 利用灭活的病毒诱导细胞融合，存在着许 多问题，如病毒制备困难、操作复杂、灭 活病毒的效价差异大、实验的重复性差、 融合率很低等。目前，这种方法主要适用 于动物细胞融合，用于实验室研究。
• 用于研究细胞的核质关系 • 用于解释疾病的发生机制 • 用于基因定位研究 • 用于衰老机制的研究 • 用于生产单克隆抗体 • 动物细胞融合用于动物育种
36
1、用于研究细胞的核质关系
• Prescott等1972年首先应用离心术结合细 胞松弛素B分离哺乳类动物细胞的胞质体获 得成功，为研究哺乳类细胞的核质关系、 细胞质基因的转移开创了新途径。
3
• 细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技 术之一，已在农业、医药、环保等领域取 得了开创性的研究成果，而且应用领域不 断扩大。
• 细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、 遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因 定位、衰老控制等理论领域的研究提供了 有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、 遗传学、发生生物学，特别是在单克隆抗 体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分
• 杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与 细胞的某一性状表达与否相联系，从而可 以实现把基因定位于某一染色体或某一区 段上。
• 1967年Weise等发现在人和鼠的融合细胞中， 人的染色体优先丢失，利用这一特点可以 对人染色体上的基因进行定位。
39
4、用于衰老机制的研究
• Tam等采用细胞融合的方法在干细胞研究中 揭示了衰老的分子机制：衰老是一个可逆 的过程，它决定于直接或间接控制端粒长 度及端粒酶活性的生物分子之间的平衡作 用，通过改变染色质的状态进而进行表观 遗传修饰调节基因表达。
18
聚乙二醇（PEG）诱导法的步骤
1. 将两种不同亲本细胞各取5×l06个混匀； 2. 离心沉淀，吸去上清液； 3. 加1ml 50%PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟； 4. 加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液； 5. 加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加
培养液至 5ml，37℃的CO2培养箱中培养； 6. 6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。
8
一、生物法
• 1958年日本学者冈田善雄首先观察到血凝 性病毒（HVJ）可引起小白鼠腹腔中的艾氏 腹水瘤细胞（ETC）的融合。
• 冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠 定了方法学基础，这使得病毒类成为研究 最早的促融剂。
9
• 一些致癌病毒虽然能够诱导细胞融合，但 由于具有毒性大等潜在的危险性而在应用 上收到很大的限制，由此科研人员试图尝 试使用灭活的病毒来作为促融剂。
22
1、电脉冲诱导细胞融合技术
• 电融合的原理：电融合法是在短时间强电场的
作用下，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时失去其 高电阻和低通透特性，然后在数分钟后恢复原状， 当可逆电击穿发生在2个相邻细胞的接触区时，即 可诱导它们的膜相互融合，从而导致细胞融合。