细胞生物学实验实验一不同显微镜的使用及细胞一般形态结构的观测[实验目的]通过本实验，使学生巩固普通光学显微镜的使用，学习相差显微镜、暗视野显微镜和荧光显微镜的使用方法，学习显微测量及显微摄影的操作方法，增强对细胞的形态和真实大小的感性认识。

通过本实验操作，要求学生掌握细胞形态结构的基本观测方法与技术，为进一步的细胞生物学研究打好基础。

[实验原理]应用显微镜的成像原理(详见翟中和等主编《细胞生物学》，第三章第一节)，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，观察细胞形态，得出细胞的大小。

该实验完成需时6学时。

[实验材料、试剂和仪器]一、仪器普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、显微拍摄系统、37℃温箱、镜台测微尺、目镜测微尺等。

二、材料洋葱根尖切片标本，念珠藻永久装片，兔肝细胞标本，夹竹桃花丝毛细胞，人口腔上皮细胞等。

三、试剂生理盐水，10µg/mL罗丹明123染液（溶于甲醇，避光于4℃保存）[实验步骤]一、暗视野显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。

用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生理盐水中，盖上盖玻片，略微压片，用滤纸条吸去盖玻片四周多余的水分。

2、将上述装片置于显微镜载物台上，在10×物镜下找到夹竹桃花丝毛细胞清晰的图像。

3、换上暗视野聚光器，调节至最佳位置，通过聚光器上的调中螺旋调节聚光器的中心位置，得到最好的暗视野图像效果。

4、观察夹竹桃花丝毛细胞内部的显微结构和细胞质环流现象，并拍照。

5、换用高倍物镜观察时，要换用与高倍镜相匹配的暗视野聚光器，重复以上调节步骤。

二、相差显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。

用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生理盐水中，盖上盖玻片，略微压片，用滤纸条吸去盖玻片四周多余的水分。

2、将装片置于载物台上，在明视野用聚焦螺旋聚焦样品，将观察到的夹竹桃花丝毛细胞移到视野中央。

3、换上10×相差物镜和相应的相差聚光器，完全打开聚光器的孔径光阑，装上绿色滤光片，调节光源，使视野内亮度均匀。

4、拨出目镜，插入中心望远镜，找到环状光阑的亮环和相板的黑环，调节聚光器，使二者完全重合。

5、拔出望远镜，插入目镜，镜检、拍照。

6、换用高倍相差物镜观察时，要换用与之相匹配的聚光器环状光阑，重复以上调节步骤。

三、荧光显微镜观察人口腔上皮细胞1、用灭菌的牙签刮取口腔上皮细胞，涂于洁净的载玻片上，滴上一滴罗丹明123染液，于37℃温箱温育30min。

2、盖上盖玻片，吸去多余的液体。

3、将装片置于载物台上，10×物镜下找到样品焦面，关闭透射光，置于激发光为蓝光、发射绿色荧光的滤片组合块下观察线粒体。

必要的话，可换用40×荧光物镜进一步观察、拍照。

四、测微尺的使用操作1、卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺有刻度一面向下装在目镜镜面上，再旋上目镜的上透镜。

2、将镜台测微尺有刻度一面朝上放在载物台上夹好，使测微尺刻度位于视野中央。

调焦至看清镜台测微尺的刻度。

3、小心移动镜台测微尺和目镜测微尺(如目镜测微尺刻度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦)，使两尺左边的"0"点一直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重复的直线(图1)。

4、记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。

按下式计算目镜测微尺每格的长度等于多少μm目镜测微尺每格的长度（μm）=镜台测微尺的格数/目镜测微尺的格数*10图1 目镜测微尺的标定上：目镜测微尺，下：镜台测微尺五、几种不同类型细胞形态的观察及大小测量1、观察各种装片标本，注意不同类型细胞的形态及大小差异。

2、用目镜测微尺和镜台测微尺测量细胞的长、短径或半径的长度，每类被测物测3个数据，最后取平均值。

[实验结果][注意事项]1、荧光镜下观察细胞时，由于荧光易淬灭，观察时要尽量快。

2、荧光探针都有一定的毒性，因此操作时要注意防止污染皮肤和环境，如弄到手上或桌子上，应及时冲洗。

[实验报告]1、完成上述表格。

2、思考：不同物镜放大倍数下，目镜测微尺每格的单位是否相同？3、思考：不同类型显微镜的适用范围有何不同？实验二细胞膜的渗透性观察[实验目的]通过本实验，学习、掌握观察、研究细胞膜物质通透性作用的实验方法与技能。

了解细胞膜对物质通透性的一般规律。

了解溶血现象及其发生机制。

[实验原理]细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。

它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。

各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。

渗透作用是细胞膜的主要功能之一。

将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。

将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。

因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。

本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。

当红细胞置于不同等渗溶液中时，由于对各种溶质的通透性不同，因此有的溶质分子可透入，有的溶质分子则不能透入，能透入的溶质分子的速度也不同。

当溶质分子进入红细胞使细胞内溶质浓度增加时，导致水的摄入。

当红细胞吸水膨胀到一定程度时，细胞膜破裂，血红素溢出即红细胞发生溶血。

由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。

该实验完成需时3学时。

[实验材料、试剂和仪器]一、仪器普通光学显微镜、手术刀、秒表、载玻片、盖玻片、吸管、小烧杯、试管等。

二、材料鸡或鸭血细胞三、试剂1.5％氯化钠，生理盐水，0.17 mol／L氯化钠，0.17 mol／L硝酸钠，0.12 mol／L硫酸钠，0.12mol／L草酸钠，0.32 mol／L葡萄糖，0.32 mol／L甘油，0.32 mol／L乙醇，0.32mol ／L丙醇。

[实验步骤]一、红细胞渗透压的观测1、取一小烧杯，加入新鲜鸡血，迅速以十倍生理盐水稀释，制成鸡血细胞悬浮液。

2、取5支试管，编号后依次向各试管加入1.5％氯化钠5，3，2.16，1，0mL，然后分别向各试管加入蒸馏水，使每一试管总体积达到5mL，配成一浓度梯度的氯化钠溶液。

3、向每一试管加入0.5mL鸡血细胞悬液，立即轻轻摇匀。

4、稍停片刻后，观察溶血情况，并记录于表一。

二、红细胞对不同溶质的渗透性观察1、取8支试管编号，依次向各试管加入等渗溶液0.17 mol／L氯化钠，0.17 mol／L 硝酸钠，0.12 mol／L硫酸钠，0.12mol／L草酸钠，0.32 mol／L葡萄糖，0.32 mol／L甘油，0.32 mol／L乙醇，0.32mol／L丙醇各5mL。

2、向每一试管加入0.5mL鸡血细胞悬液，立即轻轻摇匀。

3、观察溶血情况，并记录于表二。

[实验结果]将实验结果记录于表一、二，并加以分析。

表一红细胞渗透压的观测表二红细胞对不同溶质的渗透性观察[注意事项]新鲜鸡血提取后要立即稀释，否则会凝固结块，影响后续实验操作。

[实验报告]完成表一、表二并对实验结果加以分析。

实验三活体染色及不同细胞结构的观察[实验目的]通过本实验，使学生掌握活体染色的基本原理和一般方法，并通过对绿豆根根尖细胞液泡系和洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的活体染色观察、了解液泡系和线粒体的形态及其在细胞中的分布。

观察胞间连丝及叶绿体的形态及其在细胞中的分布。

[实验原理]活体染色是利用某些无毒或毒性较小的染色剂显示出细胞内某些天然构造存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以至引起细胞死亡的一种染色方法。

其主要特征是染料的堆积，即染料的胶粒固定、堆积在细胞内某种特殊的构造里面。

这种堆积主要是受染料分子的电荷影响。

因为碱性染料的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，它们彼此之间会发生电吸附作用（静电吸附）。

活体染色的另一特征是专一性。

例如中性红只染液泡系，詹纳斯绿－B只染线粒体，而细胞质和细胞核在活体染色过程中并不被染色。

只有当细胞死亡或开始死亡时，细胞质和细胞核才能被染成均匀一致的颜色。

该实验完成需时4学时。

[实验材料、试剂和仪器]一、仪器普通光学显微镜（带油浸物镜）、荧光显微镜、DIC显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、双面刀片、滴管、载玻片、盖玻片等。

二、试剂Ringer氏溶液、1/3000浓度的中性红溶液、1/5000浓度的詹纳斯绿－B溶液三、实验材料黄豆（或绿豆）幼根根尖，洋葱鳞片叶表皮细胞，菠菜叶，胞间连丝永久装片[实验步骤]一、液泡系的活体染色及观察1、用双面刀片把初生的黄豆（或绿豆）幼根根尖（约1－2cm长）小心切一纵断面薄片，放在预先滴有一滴1/3000浓度的中性红溶液的载玻片中央，染色15分钟。

2、用滴管吸去染液，滴加一滴Ringer氏液，盖上盖玻片，镜检。

二、线粒体的活体染色及观察1、用镊子撕下一小块洋葱鳞片叶表皮，放在预先滴有一滴1/5000浓度的詹纳斯绿－B 溶液的载玻片中央，染色30分钟。

2、用滴管吸去染液，滴加一滴Ringer氏液，盖上盖玻片，镜检。

三、叶绿体的观察1、取一小块菠菜叶，放在预先滴有一滴Ringer氏溶液的载玻片中央，用镊子将菠菜叶夹碎，盖上盖玻片，镜检。

四、胞间连丝的观察取一片胞间连丝永久装片，置显微镜下认真观察。

[实验结果]1、中性红溶液染色结果：可见生长点细胞内有很多大小不等的被染成玫瑰红色的圆形液泡。

若观察已分化长大的细胞，可见到较大的液泡，数目较少，有时只有一个浅红色的中央大液泡，其中有些深红色颗粒作布朗运动。

2、詹纳斯绿－B溶液染色结果：可见线粒体被染成兰绿色，呈颗粒状或线条状，在细胞核周围分布得特别多。

[实验报告]1、绘图示黄豆（或绿豆）幼根根尖细胞液泡系。

2、绘图示洋葱表皮线粒体。

3、思考：用一种活体染色剂处理细胞，为什么不能同时看到多种细胞器被染色。

实验四细胞组分的分离与观察[实验目的]掌握细胞组分的分离方法（差速离心法）的原理及操作步骤，掌握离心机、组织捣碎机的使用方法。

掌握细胞组分的鉴定方法。

为进一步研究亚细胞组分的化学组成、理化特性及其功能奠定基础。

[实验原理]差速离心是指低速与高速离心交替进行，使各种沉降系数不同的颗粒先后沉淀下来，达到分离的目的。

沉降系数差别在一个或几个数量级的颗粒，可以用此法分离。

样品离心时，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。

操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。