植物组织培养一、实验目的1、掌握植物细胞无菌培养技术。

2、了解不同激素对细胞的不同诱导作用。

二、实验原理植物组织培养是20世纪60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。

它是借用无菌操作方法，培养植物的离体器官，组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整的再生植株。

植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也已显示了广阔的应用前景。

组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体育种，幼胚培养与试管受精，抗体突变体的筛选于体细胞无体系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温种质保存等方面的深入研究与实际应用，都必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法，深刻理解植物细胞的全能性。

三、实验用品1、材料半夏无菌苗。

2、仪器卧式灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱或培养室。

3、用具镊子、刀、牛皮纸、marker笔、棉线。

4、器皿试剂瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培养皿(直径9～11cm)。

1、药品与试剂1).药品(见下表)2).70％酒精四、实验方法1、培养基的配制配制培养基前先要配制母液。

母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四类。

(各类成分浓度、用量详见下表)。

表1 MS培养基母液配制(单位：mg)类别成分规定量称取量母液体积(ml) 扩大倍数配1升培养基的吸取量(ml)大量KNO3 1900 190001000 10 100 NH4NO3 1650 16500元素MgSO4·7H2O 370 3700 KH2PO4170 1700 CaCl2·2H2O 440 4400微量元素MgSO4·4H2O 22.30 22301000 100 10 ZnSO4·7H2O 8.6 860H3BO3 6.2 620KI 0.83 83Na2MoO4·2H2O 0.25 25CuSO4·5H2O 0.025 2.5CoCl2·6H2O 0.025 2.5铁盐Na2-EDTA 37.25 37251000 100 10 FeSO4·7H2O 27.85 2785有机物质甘氨酸 2.0 100500 100 10 盐酸硫胺素0.4 20盐酸吡哆素0.5 25烟酸0.5 25肌醇100 50001).大量元素母液(10倍液)分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的(60～80℃)蒸馏水中。

一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水定容至1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用。

2).微量元素母液(100倍液)分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定容至1000ml。

3).铁盐母液(100倍液)称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO4·7H2O溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。

4).有机物质母液(100倍液)分别称取50倍用量的各种有机物质，依次溶解于400ml重蒸水中，定容至1000ml，装入棕色试剂瓶中，贮存冰箱备用。

除了上述四种母液外，培养基中经常附加的各种生长素和细胞分裂素也要配成母液贮存，临用时按浓度定量吸取加入。

5).生长素如2，4－D、IAA、NAA等。

准确称取20mg，先用2ml 95％乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。

6).细胞分裂素如激动素(Kt)、6-卞基嘌呤(6-BA)。

准确称取20mg，先用2ml的1mol/L HCl或NaOH溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。

2、1L培养基的配制与分装1).取1000ml烧杯一只，加大量元素10倍母液100ml，微量元素100倍母液10ml，铁盐100倍母液10ml，有机物质100倍母液10ml。

然后加水至800ml，加蔗糖30g，NAA终浓度0.25mg/L,6-BA0.75mg/L。

待蔗糖充分溶解后用1mol/L的NaOH或HCl调酸碱度为pH5.8-6.0。

2).取一个250mL的烧杯，加200mL蒸馏水。

煮沸后加8g琼脂条，待煮到一定境界后，液体为白色，糊了就会有点偏黄，但液体中最好不要还可见条状的琼脂。

煮琼脂时顺便把刚才的800mL液体也加热至50-60度，待琼脂煮好后再混合就能避免琼脂凝固。

由于加热挥发，琼脂溶液少于200ml,混合后要定容至1L。

分装到培养用三角瓶中，每只50ml三角瓶约装25ml培养基。

分装时要避免把培养基倒在瓶口上，如果这样做了就用滤纸擦一擦，否则培养时容易引起杂菌污染。

3).把牛皮纸裁成适当大小的长方形，背靠背折起来，使成正方形，紧密裹在瓶口上，随后便可进行灭菌。

培养基的种类和附加成分是根据培养物的种类、外植体的来源以及具体的实验目的和要求来确定的。

培养基中附加的蔗糖浓度均为0.8％(m/v)。

3、培养基的灭菌把装好培养基的三角瓶放入高压灭菌锅中，盖好锅盖，我们此次用的是卧式灭菌锅，用法比较特别。

首先最重要的是要确保水加够，然后放气阀为确保安全是一直开着的，先将旋钮打在关闭上，打开电源，当第一次加热的显示灯灭了之后，转换旋钮至灭菌，当第二次加热灯灭的时候，开始计时20min，然后关闭电源，打到慢排至压力降到0.05MPa再打到快排，降到0.02MPa后再换成全排，降至零后再换成关闭，打开盖子透气，让纸慢慢变干。

放气过程有声音，所以也可以通过声音来判断是否该转换。

3、超净台的操作两小时前先用70%酒精擦拭超净台，擦好后关上挡风玻璃，按D打开紫外，接种前15分钟，关闭紫外，打开大风，稍微将挡风玻璃打开一点。

先在外面把手洗干净，然后在超净台内先用70％酒精浸泡过的棉球擦拭工作台的台面。

放入培养瓶和接种工具，接种用的镊子、解剖刀、接种针及培养皿等可事前放入，点燃酒精灯，用酒精棉球擦拭手。

把镊子、解剖刀、接种针灯插入盛70％酒精的广口瓶中。

取一瓶半夏的无菌苗，先将整瓶苗分装到各个培养皿内的吸水纸上以防交叉感染，吸干水后，把叶子切成3×5mm大的小片，打开三角瓶，把叶片投入瓶内，用接种针拨匀，重新盖上牛皮纸，扎上棉线。

用记号笔在瓶壁上写明培养材料、培养基代号，标明接种日期。

全部接种工作都是在严格无菌条件下进行的，所以要特别认真、仔细、以防杂菌污染。

五、培养和观察接种完毕后取出培养瓶，置26～28℃恒温培养箱室内，先暗处理三天再移置在光照条件下培养，定期进行观察。

一般三天染细菌（长菌处有浑浊的液体），七天染真菌（长菌处有霉和普通的霉差不多）如有污染则弃之，培养3～4周后观察实验结果。

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五、实验结果1、计算接种成功率(指没被污染的叶片数占总叶片的百分比)和诱导成功率(指诱导出细胞的叶片数占总叶片的百分比)。

如果没有添加植物激素结果又会怎样？为什么？2、人工条件下培养的植物离体器官、组织或细胞，经过分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整植株的过程说明什么问题？细胞内DNA和RNA的显示【目的要求】1、掌握显示细胞内DNA和RNA的方法。

2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布位置。

【实验原理】核酸是酸性的，它们对于碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力。

利用这两种染料的混合液处理细胞，可使其中的DNA和RNA呈现出不同的颜色，这种颜色上的差异由DNA和RNA聚合程度的不同所引起，因为甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它与聚合程度较高的DNA分子有较强的亲和力，可使DNA分子染成蓝绿色；而派洛宁分子中仅一个正电荷，可与低聚分子RNA相结合使其染成红色。

这样细胞中的DNA和RNA可被区别开来。

【器材与试剂】1、器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、注射器。

2、材料：鸡血。

3、试剂：0.2mol/L醋酸缓冲溶液、2%甲基绿染液、1%派洛宁染液、甲基绿·派洛宁混合染液。

4、试剂的配制（1）0.2mol/L醋酸缓冲溶液：用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中，混匀。

再称取醋酸钠（NaAC·3H2O）2.72g溶于100ml蒸馏水中，使用时按2：3的比例混合两液即成。

（2）2%甲基绿染液：称取2.0g去杂质甲基绿溶于100ml0.2mol/L的醋酸缓冲溶液中即成。

甲基绿粉中往往混有影响染色效果的甲基紫，它们必须预先除去，其方法是将甲基绿溶于蒸馏水中，放在分液漏斗中加入足量的氯仿（三氯甲烷）用力振荡，然后静置，弃去含甲基紫的氯仿，再加入氯仿重复数次，直至氯仿中无甲基紫为止，最后放入40 C温箱中干燥后备用。

（3）1%派洛宁染液：称取1g派洛宁（吡罗红）溶于100ml0.2/L醋酸缓冲溶液中混匀。

（4）甲基绿派洛宁混合染液：将2%的甲基绿液和1%的派洛宁液以1：1的比例混合均匀即可。

该液应现配现用，不宜久置。

【内容与方法】1、去鸡血一小滴在干净的载玻片一端，用另一载玻片的一端紧贴血滴，待血液沿其边缘展开后，以30~400角向玻片的另一端推去，制成较薄的血涂片，室温下晾干。

2、固定：将晾干的血涂片浸入70%乙醇中固定10分钟，取出后在室温下晾干。

3、染色：滴甲基绿派洛宁混合染液于血膜上，染色15min。

4、冲洗：用蒸馏水冲洗标本片，并用吸水纸吸去玻片上多余的水分，但不要吸得过干。

5、分化：将血涂片在95%酒精中迅速地过一下，进行分色，取出晾干。

6、观察：光镜下可见细胞质呈现红色，细胞核呈绿色。

【作业与思考】1、简述DNA和RNA的染色原理。

2、细胞核中核仁理论上应被染成何种颜色？为什么？鸡血细胞体外融合【实验目的】（1）了解聚乙二醇诱导体外细胞融合的基本原理。

（2）通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。

【实验原理】细胞融合又称体外细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体细胞同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组和在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。

细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。

依据融合过程采用的助融剂的不同，细胞融合可分为：1.病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒；2.化学因子诱导的细胞融合，如PEG；3.电场诱导的细胞融合；4.激光诱导的细胞融合。

PEG是乙二醇的多聚合物，存在一系列不同分子质量的多聚体。

PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。

该方法应用相对分子质量为400-6000的PEG溶液引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。

融合的频率和活力与所用PEG的分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。