细胞生物学实验班级：生科142姓名：旷江学号：10143131组号： 2小组成员：旷江、韦立尧、莫霞指导老师：范立强、李鹏飞华东理工大学应用生物学系摘要本次细胞生物学实验通过细胞形态与结构的观察技术，细胞化学，细胞生理，细胞培养与分析，细胞周期分析，细胞成分分离与分析，细胞增殖与染色等技术对动植物细胞进行细胞形态结构的观察、细胞生理过程的研究、细胞培养与细胞分析、细胞冻存与复苏等，以此来研究动植物细胞的结构、功能和各种生命规律。
关键词：细胞增殖、细胞染色、冻存复苏、生理过程、形态结构AbstractThe cell biology experiment was carried out by cell morphology and structure observation technique, cytochemistry, cell physiology, cell culture and analysis, cell cycle analysis, cell fractionation and analysis, cell proliferation and staining. Observation of cell physiological processes, cell culture and cell analysis, cell cryopreservation and resuscitation, in order to study the structure of animals and plants, functions and a variety of laws of life.Key words: cell proliferation, cell staining, cryopreservation, physiological processes, morphological structur目录第一章综述 (1)1.1实验目的 (1)第二章实验原理 (2)2.1实验流程和应用实验方法 (2)2.2细胞器活体染色与显微观察 (2)2.3细胞骨架的观察 (3)2.4细胞冻存复苏 (3)2.5细胞冻存复苏活力检测 (3)2.6哺乳动物细胞的基因转染 (4)2.7细胞凋亡诱导和分析 (4)第三章实验仪器及试剂 (6)3.1实验仪器 (6)3.2实验试剂 (6)第四章实验步骤............ 错误！未定义书签。
4.1细胞培养和传代 (7)4.1.1洗涤细胞 (7)4.1.2消化 (7)4.1.3接种 (7)4.1.4培养 (7)4.2细胞器活体染色与显微观察 (7)4.3细胞骨架的观察 (7)4.4细胞冻存 (8)4.5细胞复苏 (8)4.6细胞冻存复苏活力检测 (8)4.6.1台盼蓝染色法 (8)4.6.2MTT法 (8)4.6.3XTT法 (8)4.7哺乳动物细胞的基因转染 (8)4.8细胞凋亡诱导和分析 (8)第五章实验结果及分析 (10)5.1动物细胞转染及质粒抽提 (10)5.1.1质粒抽提 (10)5.1.2OD260及OD280测定 (10)5.1.3细胞活体染色 (11)5.2染色法鉴定细胞活力、细胞器及细胞骨架的观察 (12)5.2.1中性红观察细胞系 (12)5.2.2考马斯亮蓝染色细胞骨架观察 (13)5.2.3传代细胞培养 (14)5.3细胞冻存、复苏及MTT法测定细胞活力 (15)5.3.1MTT检测细胞生长状态 (15)5.3.2细胞冻存复苏 (16)第六章思考与讨论 (18)6.1思考题 (18)6.2实验讨论 (20)第七章致谢 (21)第一章综述1.1 实验目的细胞生物学(cell biology)是在显微、亚显微和分子水平三个层次上，研究细胞的结构、功能和各种生命规律的一门科学。
细胞生物学研究主要有十个方面，细胞形态与结构的观察技术，细胞化学，细胞生理，细胞培养与分析，细胞周期分析，细胞成分分离与分析，细胞增殖与染色技术，细胞凋亡的测定，细胞工程基础技术和分子细胞生物学技术。
本实验主要侧重于细胞形态与结构的观察技术，细胞生理，细胞培养与分析，细胞凋亡的测定和细胞工程基础技术五部分，主要达到以下目的:(1)、学习并掌握细胞生物学的基本实验方法和技能，包括细胞培养，细胞计数，细胞染色和细胞冻存复苏等。
(2)、实践细胞生物学理论知识，巩固细胞生物学知识的掌握。
(3)、强化实验设计能力，培养科研思维。
第二章 实验原理2.1 实验流程和应用实验方法詹纳斯绿B&考马斯亮蓝R250染色细胞骨架 MTT(XTT)法测定细胞活力阳离子脂质体介导的基因转染 H 2O 2诱导细胞凋亡相差&荧光显微镜观察结果 Ho33342和PI 双重染色鉴定细胞传代培养细胞显微计数2.2细胞器活体染色与显微观察细胞活体染色是指应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些细胞结构而又很少影响细胞生命活动的染色方法。
本实验应用的是詹纳斯绿B 和中性红进行染色观察。
詹纳斯绿B 能专一的对线粒体进行活体染色。
线粒体中细胞色素氧化酶使染料詹纳斯绿B 保持氧化状态，即有色状态，呈蓝绿色，而在周围的细胞质中, 染料被还原，呈无色状态。
中性红对高尔基体、高尔基体的染色具有专一性。
只将活细胞中的高尔基体染成红色，细胞核与细胞质完全不着色(这可能与高尔基体中某些蛋白质有关)。
2.3 细胞骨架的观察真核细胞胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架。
根据纤维直径、组成成分或组装结构的不同分为微管、微丝和中间纤维。
微丝是肌动蛋白（F-actin）构成的纤维，在光学显微镜下看不到，在不同种类的细胞中，它们与某些结合蛋白一起形成不同的亚细胞结构。
考马斯亮蓝染色法可以看在显微镜下观察到微丝结构。
考马斯亮蓝R250可以染各种蛋白，并非特异染微丝。
细胞经适当浓度Triton X-100溶液处理，质膜结构中及细胞内许多蛋白质被溶解，而细胞骨架中的蛋白质却不被破坏，经固定和考马斯亮兰R250染色后，胞质背景着色弱，可在光镜下观察到由微丝组成的纤维束。
2.4 细胞冻存复苏细胞长期培养过程中可能因为微生物污染或基因型改变等导致具有优良特性细胞系丢失，细胞可经快速冷冻并几乎无限期保存在非常低的温度下，如液氮中，可以防止此类问题。
不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水会形成冰晶，导致细胞内发生一系列变化，导致细胞死亡。
在培养液中加入保护剂如甘油和二甲基亚砜（DMSO），可使冰点下降，在缓慢的冻结条件下，使细胞内水分在冻结前析出胞外，使细胞免受损伤；溶解细胞时，解冻要快，使之迅速通过细胞最易受损的-5℃—0℃后，细胞仍能生长，活力不受损伤。
2.5 细胞冻存复苏活力检测细胞活力检测分为细胞死活和细胞生命力两部分，这两点是相互贯通的，死细胞没有生命活力，有生命活力的细胞都是活细胞。
一般死活细胞检测有以下四种方法：（1）、染色排除法（最常用）：台盼蓝法（死细胞染成蓝色，活细胞不着色），苯胺黑法（死细胞染成黑色，活细胞不着色）。
（2）、荧光排除法：生活力强的细胞能发出强烈的黄绿色荧光；生活力的细胞发出荧光也较弱；死亡细胞无荧光。
（3）、细胞内酶与特定试剂的显色反应：MTT比对实验：琥珀酸脱氢酶可使MTT 分解产生蓝色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围，其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。
（4）、克隆形成试验。
细胞生命力可以用细胞生长曲线测定来表征。
细胞生长曲线是了解培养细胞的增殖详细过程及细胞生长基本规律的重要手段。
一般有直接计数法，AKP法，ATP法，3H脱氧胸苷掺入法，MTT法，XTT法等，和细胞死活检测方式有相同之处。
2.6 哺乳动物细胞的基因转染基因转染是将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内，并使核酸在细胞内表达的过程，广泛用于基因的结构和功能分析、建造疾病的动物模型和药物筛选模型、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物、生产药用蛋白和保健蛋白等研究。
基因转染分为转染和感染两大类。
转染是通过生化或者物理方法将目的基因导入真核细胞中。
感染是通过病毒介导，用基因组中携带有克隆目的片断的病毒来感染靶细胞。
转染按照方式的不同又可有直接注射法，脂质体转染法，受体介导的基因转移，显微注射法，电穿孔法，碳酸钙共沉淀法等。
本实验采取阳离子脂质体介导的转染。
阳离子包被的脂质体可以带负电的DNA吸附，形成复合物（DNA在内部），而脂质体可以透过细胞膜，从而将DNA带入胞内，DNA进入细胞核，和基因组整合，继而表达特定标记蛋白。
2.7 细胞凋亡诱导和分析细胞凋亡，即程序性细胞死亡，是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。
过程包括诱导性因素和抑制性因素，诱导性因素是凋亡程序的执行者，包括激素和生长因子失衡、免疫性因素、微生物学因素等，抑制性因素包括细胞因子（IL-2，神经生长因子）和某些激素等。
凋亡细胞的检测可以通过形态学、膜通透性、膜成分外露和DNA变化等方式进行。
比较显著的是形态学变化（形成凋亡小体等）和细胞生理生化改变。
生化特征包括胞浆内Ca2+浓度升高，细胞内活性氧增多，质膜通透性变大，DNA 内切酶活性被激活升高，Ⅱ型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶（Calpain）活性升高等现象。
本次实验基于质膜通透性变大的生化特征。
凋亡细胞的质膜通透性增大，相对分子量大的或小的与DNA结合的荧光染料都可以进入细胞内，进而同DNA 结合使其染色。
而正常细胞的质膜通透性较小，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如溴化乙啶）不能进入细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如吖啶橙）仍能被细胞摄取。
因此可以利用吖啶橙和溴化乙啶双染色法区别正常细胞和凋亡细胞。
细胞内DNA出现吖啶橙标记（绿色荧光）而不出现溴化乙啶标记（红色荧光）的为正常细胞，而在细胞内既出现吖啶橙标记也出现溴化乙啶标记的为凋亡细胞。
第三章实验仪器及试剂3.1 实验器材CO2培养箱，倒置显微镜，超净台，移液器，血球计数板，离心机，血球计数板，37℃水浴，-80℃冰箱，液氮和液氮容器，六孔板，96孔培养板，移液枪，枪头，酶联免疫检测仪，电子天平，比色皿，分光光度计3.2 实验试剂无钙、镁磷酸盐缓冲液(PBS)细胞消化液：0.25%胰蛋白酶-0.2%EDTA培养基（DMEM液或RPMI 1640）小牛血清或胎牛血清1%詹纳斯绿b染液：称取1g詹纳斯绿b溶于100ml蒸馏水中，稍加热(30～45℃)使之快速溶解，用滤纸过滤，即为1%原液,装入棕色瓶备用。
为了保持其充分的氧化能力，最好是临用前现配。
1:15 000中性红水溶液：中性红5mg溶于75ml蒸馏水中1%中性红溶液：称取0.5g中性红溶于50ml蒸馏水中。