• 足印法结果显示， Hoechst 33342能结合 于拓扑异构酶II的启动子DNA区域，而可 能抑制有关转录因子与其相应DNA结合 位点的结合。
• Hoechst 33342 的竞争性结合序列主要是 ICB2，这是一个已知的拓扑异构酶IIa启 动子抑制区。
凝胶延迟实验
• 凝胶延迟实验也称Gel Shift或Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) 。
酶学）、凋亡（形态、流式细胞计数）； • 分子水平：蛋白表达（Western, 流式细胞计
数），蛋白活性（ 酶学、转运），DNA扩增、 变异（Southern、PCR），mRNA表达 （Northern, RT-PCR）。
转录调控研究方法在药理学中 的应用
• 肿瘤的发生和发展，与肿瘤细胞的基因 变异和表达异常有密切关系。针对肿瘤 细胞特异性的基因表达异常，可能发现 有特异性作用的抗肿瘤药物。
肿瘤药理学研究方法概述
药理学研究方法的演进
• 药理学研究方法，通常是以各种生理生 化方法为基础的。
• 随着生命科学的发展，药理学研究从整 体，发展到组织、细胞和分子水平。
• 现代分子生物学的发展，为药理学研究 提供了更丰富的手段。
肿瘤药理ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ研究常规方法
• 整体水平：荷瘤小鼠（瘤体生长、转移）； • 细胞水平：细胞增殖（MTT）、分化（形态、
DNase I 足印：Distamycin A（a）和Hoechst 33342 (b)可单独产生DNA足印， Distamycin A 的DNA结合作用比Hoechst 33342 更广泛。Hoechst 33342 主要 结合于ICB2的位置。(c)核蛋白可与Hoechst 33342 竞争结合ICB2的位置。 ICB1和2显示拓扑异构酶IIa基因启动子上CCAAT序列位置。
• 多数转录因子是DNA结合蛋白，结合于 靶基因的调节DNA元件，或称为顺式作 用元件（cis-acting element）。
• 转录因子也称为反式作用因子（transacting factor）。
• 哺乳类细胞大约含有2－3千种转录因子， 有限数量的转录因子，是通过组合效应 来实现对其自身和其它基因表达调控的。
• 典型的核心启动子单元是由TATA盒（位于转 录起始点上游25bp左右）和嘧啶富含区单元 （转录起始点）组成，它们是PolII的主要DNA 靶点。
• 启动子近端单元通常位于转录起始点上 游50－200bp 。
• 启动子远端单元则可位于转录起始点上 游或下游的不同距离的区域。
• 转录因子与它们结合，调节PolII的活性， 影响转录起始过程。
• 转录调控是通过影响在起始、延长、终 止过程中PIC的组装和催化效率来达到的。 在起始阶段PIC的组装，是整个转录过程 的限速环节。
转录因子
• 不同基因的表达是通过一个复杂的调控 网络调节的，在这一网络中，特定的转 录因子将信号传递给特定的靶基因。
• 外界刺激信号通过信号转导通路，经过 一系列酶促反应，影响相应的转录因子， 最终引起相关基因的改变，产生一定的 生物学效应。
转录调控研究的常用方法
• 转录调控研究可分为两类，既蛋白质与 DNA的相互作用，和蛋白质与蛋白质的 相互作用。
蛋白质与DNA的相互作用
DNA足印法
• 这是一种直接观察DNA结合蛋白与特定 的DNA序列相结合的方法。
• 基本原理：转录因子与DNA靶序列结合 后，可保护所结合的DNA区域不受 DNase I 或其它分子的消化。通过比较转 录因子存在与否时，消化的DNA条带分 布，可以了解转录因子所结合的具体 DNA序列。
NIH3T3细胞提取核蛋白，与放射性标记的ICB2 DNA双链探针结合后电泳。 1：仅含有探针与核蛋白； 2，3：分别加入非标记的竞争性原始或变异探针 （含有NF-YA的结合位点）；4，5，6：分别加入NF-YA，NF-YB和Sp1抗体。 F，游离探针；S，迁移的DNA－蛋白质复合物；Su，迁移的DNA－蛋白质 －抗体复合物。
• 基因表达调控，是现代生物医学研究的 前沿领域。
• DNA转录形成RNA，RNA翻译形成蛋白 质，这一过程称为基因表达。
• 基因表达的调控，可以发生在各个水平 上。
RNA转录的有关理论
• 基因5‘非编码区含有转录起始区和相应基因 序列，称为启动子。
• 启动子由三类DNA序列组成，一类是基础（或 核心）启动子单元，一类是启动子近端单元， 一类是启动子远端单元。
核蛋白凝胶迁移实验中，Hoechst 33342可与ICB2探针发生特异性竞争结合。 (a)ICB2探针；(b)GC富含区探针。
• 结果表明，ICB2的结合蛋白复合物含有 NF-YA和NF-YB。而Hoechst 33342可与 结合蛋白复合物发生特异性竞争，结合 ICB2。
应用示例
• 拓扑异构酶IIα是肿瘤治疗的一个重要靶 点。肿瘤细胞的拓扑异构酶II表达下降， 可能是其对该类细胞毒性药物产生抗性 的机理。
• Hoechst 33342是合成的化合物，可促进 拓扑异构酶II的表达，可能作为克服肿瘤 抗药性的辅助化疗药物。
Western Blot：与对数生长期（1）相比，生长停滞期的细胞（2）的拓扑异 构酶IIa表达明显下降。Hoechst 33342处理（3）可恢复生长停滞期的细胞（2） 拓扑异构酶IIa表达。
• 是另一种直接观察DNA结合蛋白与特定的DNA 序列相结合的方法。
• 基本原理：转录因子与DNA靶序列结合后，形 成的复合物在非变性凝胶电泳时的迁移速度， 明显慢于单独的DNA片段。根据标记的DNA片 段的迁移情况，可以很敏感地反映出蛋白质与 其DNA靶序列的结合。
应用示例
• 为进一步验证ICB2序列的结合蛋白，用 ICB2探针作了凝胶迁移实验，并对结合 蛋白的可能身份，进行确定。
组合效应：三种转录因子及其DNA结合序列，通过不同的排列组合， 可产生九种调节方式。
• 转录因子一般有两个特征性的功能簇， 一个是DNA结合功能簇，可与基因的特 定调节位点，即顺式调节单元直接结合；
• 另一个功能簇则显示转录激活或抑制活 性。
• 有时，这两个功能簇也可位于不同的蛋 白分子上，共同形成分子伴侣。