实验二细菌的芽孢染色和荚膜染色
生物111班杨明轩1102040128
一、实验目的
1、学习并掌握细菌芽胞染色的原理和方法。

2、学习并掌握细菌荚膜染色的原理和方法。

二、实验原理
（一）细菌的芽孢染色
芽孢通常指某些细菌在生长后期于细胞内形成的一种圆形、椭圆形或圆柱形的、厚壁、折光性高、含水量极低而抗逆性极强的内生休眠体。

芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染色剂亲合力不同的原理，用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈现出不同的颜色而加以区别。

芽孢通常具有厚而致密的壁，透性低，不易着色和脱色，当用着色力强的弱碱性染色剂孔雀绿在加热条件下染色师，芽孢和菌体同时着色，进入菌体的染色剂可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。

经对比度大的复染液番红染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，呈绿色；而菌体被复染剂染成红色，易于区别。

（二）细菌的荚膜染色
荚膜是包围细菌细胞的一层粘液性物质，具有明确的外缘，牢固地附着在菌体细胞壁外；荚膜的主要成分是多糖，不易着色，其含水量高达90%以上，易变形。

荚膜染色通常采用衬托染色法或称负染法，即将菌体和背景分别着色，从而把不着色且透明的荚膜给衬托出来。

三、实验材料
1、菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），26~28℃培养2~3天；
钾细菌（Bacillus mucilaginosus），点接于阿须贝平板上，26~28℃培养3天。

2、染色剂：孔雀绿染液、番红染液，石炭酸复红、墨汁（已过滤）
3、其他：载玻片、无菌水、洗瓶、擦镜纸、吸水纸、二甲苯、香柏油、接种用具
四、实验方法
（一）细菌的芽孢染色
1、制片：将枯草芽孢杆菌涂片、干燥固定。

2、染色：用吸水纸块盖住涂片处，然后在吸水纸张滴加孔雀绿染液至饱和。

加热使染液微冒蒸汽后，保持5min。

加热时应不断添加染液，不要使吸水纸干燥。

3、水洗：待玻片冷却后，用镊子除去吸水纸，再用水平轻轻冲洗至孔雀绿不再褪色为止。

4、复染：用番红染液染色2~3min。

5、镜检：涂片干燥后，置油镜下观察。

6、清理：整理桌面，将显微镜恢复原样，将废片放入废片缸内。

（二）细菌的荚膜染色
1、制片：在洁净的载玻片的中央滴加1滴无菌水，取少许钾细菌制成涂片，在空气中风干。

2、染色：用石炭酸复红在涂片处染色4~5min，水洗，稍风干。

3、滴加一滴墨汁在载玻片的一侧，左手持此玻片，右手拿一干净玻片作推片用。

将推片边缘凭证的一端与混合菌液成30°胶接触，顺势将菌液推开（不要太用力），使其涂成一薄层，并在空气中充分自然干燥。

4、镜检：玻片自然干燥后，置油镜下观察。

6、清理：整理桌面，将显微镜恢复原样，将废片放入废片缸内。

六、思考题
1、为什么在孔雀绿加热染色时，要待玻片冷却后才能冲洗？
答：因为经过加热后细菌提和孢子体均会因加热膨胀，如果此时冲洗冷却会导致细菌体和孢子体因为热胀冷缩过于剧烈而发生形变从而影响两者之间形状区别的观察。

同时对于玻片也会因为热胀冷缩原因可能会产生炸裂损坏玻片，造成伤害。

2、分别从菌龄、制片等方面，简述细菌芽胞染色需要注意的技术要领。

答：（1）进行芽孢染色的菌株应注意其培养时间。

如菌株培养时间过长，芽孢则从菌体脱落出来；如培养时间过短，达不到细菌生长的后期，则可能出现芽孢数量较少的现象。

（2）染色时，用吸水纸盖住涂片并加热是为了让染色剂更好的进入芽孢。

但加热时要注意加热到微冒蒸汽即可，不要使染液沸腾，并注意不断添加染液。

（3）加热完成后，有等玻片自然冷却后在进行水洗，而且水洗要充分。

3、简单染色能否观察细菌荚膜？请解释原因。

答：不可以。

因为荚膜是包围细菌细胞的一层粘液性物质，具有明确的外缘，牢固地附着在菌体细胞壁外；荚膜的主要成分是多糖，不易着色，其含水量高达90%以上，易变形。

简单的染色法原理是将荚膜染色，但是荚膜含水量极高，无法着色。

因此无法通过简单染色观察。

4、细菌的荚膜有何特点，在对其染色观察结果时应注意什么？
答：（1）荚膜是包围细菌细胞的一层粘液性物质，具有明确的外缘，牢固地附着在菌体细胞壁外；荚膜的主要成分是多糖，不易着色，其含水量高达90%以上，易变形。

（2）由于荚膜的含水量极高，因此在实验过程中为了保持荚膜的形态，制片不能用火烤，以免荚膜失水后形态改变。

荚膜有一定的粘性，因此取菌时要少取些，涂菌是要尽量涂开，使菌体分散。