实验报告
课程名称： 植物生理学（乙）指导老师： 廖敏 成绩： 实验名称： 叶绿素理化性质和含量 实验类型： 定量探究型 同组学生姓名： 方昊
一、实验目的和要求（必填）
三、主要仪器设备（必填）
五、实验数据记录和处理
七、讨论、心得
二、实验内容和原理（必填） 四、操作方法和实验步骤 六、实验结果与分析（必填）
一、实验目的和要求
掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法；
二、实验内容和原理
以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量
分析。

原理如下：
1. 叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取；
2. 叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素
分开；
3. 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素；
4. 叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光；
5. 叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a 、b 及总量，而652可直接用于总量分析。

专业：农业资源与环境 姓名： 吴主光
学号： 3110100403 日期： 2013.10.17 地点： 生物实验中心
装
订 线
三、主要仪器设备
1. 天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机、研具、各种容（量）器、洒精灯等
四、操作方法、实验步骤以及实验现象
定性分析：
鲜叶5g+95%30ml（逐步加入）,磨成匀浆
过滤入三角瓶中，观察荧光现象：透射光绿色，反射光红色。

皂化反应（3ml）：加KOH数片剧烈摇均，加石油醚5ml和H2O1ml分层后观察：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光；下层呈绿色，为叶绿素，吸收红光和蓝紫光。

取代反应（1）：加醋酸约2ml，变褐（去镁叶绿素）；取1/2加醋酸铜粉加热，变鲜绿色，为铜代叶绿素。

取代反应（2）：鲜叶2-3cm2，加Ac-AcCu 20ml加热，观察： 3 min变为褐绿色的去镁叶绿素， 5 min后，变为深绿色的铜代叶绿素。

叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：
皂化反应的上层黄色石油醚溶液（稀释470nm OD 0.5-1）
反复用石油醚粹取，直到无类胡萝卜素，离心得叶绿素(盐)（稀释663nm OD 0.5-1)
在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰.
叶绿素定量分析：鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取0.2ml加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb 和Chl总量的值。

五、实验数据记录和处理
OD645 = 0.104 OD652 = 0.147 OD663 = 0.246
Ca(mg/L)=12.7 OD663 - 2.69 OD645 = 2.84 (mg/L)
Cb (mg/L) =22.9 OD645 - 4.68 OD663 = 1.23 (mg/L)
CT (mg/L) = Ca + Cb = 4.07 (mg/L) 或 OD652× 1000 / 34.5 = 4.26 (mg/L) Chla含量(mg/g.FW) = （Ca(mg/L)/1000）×2/ 0.1×5/ 0.2 = 1.42 (mg/g.FW)
Chlb含量(mg/g.FW) = （Cb(mg/L)/1000）×2/ 0.1×5/ 0.2 = 0.62 (mg/g.FW)
Chl总含量(mg/g.FW) = （CT(mg/L)/1000）×2/ 0.1×5/ 0.2 = 2.04 (mg/g.FW)
六、实验结果与讨论
1.吸收光谱图谱分析
胡萝卜素吸收波长范围集中在400-500nm的蓝紫光区，其中占主要的440-480区间内出现了两个峰值。

叶绿素吸收波长范围集中在400-500nm的蓝紫光区以及600-700nm的红橙光区，其中蓝紫光区峰值明显大于红橙光区。

2.定量分析
由OD652计算得出的Chl总含量与OD625及OD663得出的值稍存在一定的偏差，经分析可能原因：
1.视觉误差：由于操作者个人视力的因素不可能将仪器刻度盘绝对准确
地调至645nm、652nm以及
663nm，另一方面由于叶绿素a、b的吸收峰很陡，从而此时对3个数值的调准偏差应尽量减少到最低；
2.实验材料制备的误差：实验制备材料时可能由于叶绿素叶黄素等没有
充分溶解，导致后面测得的数剧偏低。

3.仪器误差：仪器本身造成实验结果产生误差；
七、心得
实验中最重要的部分不是分光光度计对于吸收峰的测定，最重要的部分应该是实验材料的制取，制取材料的时候如果没有制备好，后面测得的数据会有很大的偏差，与标准值差距也会非常大。