兔抗牛血清白蛋白免疫血清的制备及鉴定【摘要】目的：制备兔抗牛血清白蛋白血清，并对其进行效价的鉴定。
方法：由牛血清和石蜡油、羊毛脂、卡介苗等进行研磨制成弗氏完全佐剂，对兔子不同部位进行一周一次连续四周的抗原免疫，采取颈动脉放血收集并分离血清，再通过双向免疫扩散实验进行血清效价的鉴定。
结果：：双向琼脂扩散在BSA0．5g/mL 的浓度时，测得抗血清效价为1：8结论：BSA免疫家兔可获取效价较高的抗血清。
【关键词】牛血清白蛋白（BSA）、效价、免疫Preparation and identification of rabbit anti-BSA serum Abstract: Objective The antisera of BSA (bovine serum albumin) was prepared and the titer was identified. Methods The Freund’s adjuvant was grinded with the BSA, paraffin oil, lanolin and bacille Calmette-Guerin (BCG）. Then the rabbit was immunized for four times in a month. After a week carotid bloodletting had been done to get the antisera from the rabbit. At last the titer was identified by double immunodiffusion test. The titer of antiserum was 1:8 in double immunodiffusion .Conclusion:The higher titer of antiserum is obtained by immunizing rabbits with BSAKEY WORDS Bovine serum albumin(BSA),Titer,lmmunity可溶性抗原（入血清、细胞浸出液、外毒素等）和相应抗体结合，在食量电解质存在下，经过一定时间，在二者比例适当时形成肉眼可见的沉淀物。
可分环状沉淀实验，絮状沉淀实验，琼脂扩散实验（单向琼脂扩散实验。
多向琼脂扩散实验），免疫电泳。
由于沉淀反应抗原多系胶体溶液，沉淀物主要是由抗体蛋白所组成，制备可溶性抗体的物质有很多，但处理的方法繁琐或价格昂贵，并且效价不高。
因此，寻找简单、快速、易操作的方法提供教学单位实际应用具有重要的现实意义。
在免疫学的教学中，沉淀反应是必不可少的，而在本科学生中此实验的操作又必列其中。
目前市场上生物制品缺乏某种可溶性抗原与可溶性抗体的配备供应，且价格昂贵。
为了节约经费，使用方便，采用牛血清白蛋白(BSA）免疫家兔，以获取较高的BSA的抗血清，现将方法介绍如下。
[1]1 材料与方法1. 1 动物、试剂与仪器动物：家兔（7只），无免疫接种史，体重2.0—2.5kg,雌雄并用，由广东医学院动物室提供。
试剂：生理盐水、石腊油和羊毛脂、卡介苗、碘酒、75%酒精、青霉素、15g/L琼脂巴比妥溶液、15克/L盐水琼脂（含抗体—兔抗牛血清白蛋白），实验仪器：无菌乳钵、试管、吸管、剪刀、镊子、注射器、止血钳、载玻片、打孔器、微量加样器、湿盒、三用电热恒温水箱（SHH.W21.600,天津泰特仪器厂）、离心机（Anke TDL80-2B）电泳仪(DDY-7C型北京六一仪器厂)、电泳槽（DDC-3813型北京六一仪器厂）、牙签1. 2 动物免疫1.2.1 免疫方案表1 动物免疫方案免疫次数免疫时间免疫剂量免疫途径第一次2011.09.14 0.5 ml 家兔后脚足跖两侧第二次2011.09.21 0.5 ml家兔后脚腘窝淋巴两侧第三次2011.09.28 1.0 ml家兔背部皮内第四次2011.10.05 1.0 ml 家兔上肢或下肢肌肉两侧注：第四次免疫不加佐剂，只注射抗原。
1.2.2 动物免疫和血清制备动物免疫1.制备抗原[2]将石腊油和羊毛脂（V/W=3:1)加热倾入乳钵中,待冷后加入卡介苗(10mg/ml),研磨。
逐滴加人丙种球蛋白，直至完全磨成乳剂。
2. 动物免疫首次免疫时在家兔两侧后脚足跖各注射0.25ml弗氏完全佐剂；间隔1周进行第二次免疫，两侧后脚腘窝淋巴结处各注射0.25ml弗氏完全佐剂；1周后对家兔背部不同的五个点进行皮内多点免疫，每个点各注射0.2ml弗氏完全佐剂；第四周对家兔进行最后一次的免疫注射，注射部位是家兔两侧上肢的肌肉，每侧各注射0.5ml不加佐剂的抗原。
每次注射抗原都应密切观察兔子的反应状况，避免兔子在免疫过程中出现意外，造成中途死亡。
3.血清制备（采用家兔颈动脉放血法）将家兔仰卧固定在解剖台上，让兔头下垂，使整个颈部伸直露出。
沿正中线从下颌到胸骨柄约10cm，剪毛、消毒皮肤。
沿正中线从下颌到胸骨柄切开皮肤，将皮肤和皮下组织剥离，并且在切口上下作横切开，然后将两侧皮外翻掀开，钝性分离皮下组织。
兔暴露气管前面的胸锁乳突肌，在肌束下面，靠气管两侧可明显暴露颈动脉，将颈动脉完全分离露出,注意迷走神经。
在颈动脉近心端、远心端用两把止血钳钳住，再用一把止血钳在靠近远心端止血钳位置钳住血管在远心端两个止血钳间用剪刀剪断，翻转中间止血钳使血管呈弧形，用眼科剪刀在靠近中间止血钳处剪一小口，手持中间止血钳将颈动脉切口引入无菌烧瓶中，放开近心端止血钳，血液即喷入容器内，室温血液凝固后，用无菌毛细管沿瓶壁边缘将血块与瓶壁分离，先放在37℃2h，再放4℃过夜，使血清充分析出。
然后用无菌毛细管收集血清。
离心，去除红细胞。
1.3 免疫血清的鉴定1.3.1 抗血清效价的鉴定采用双向免疫扩散试验进行鉴定。
取1ml抗血清，按倍比稀释法将其稀释为：1：1（原液）、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32等稀释度。
用10ml吸管吸取溶化的15g/L盐水琼脂4ml，浇注于洁净载玻片上。
待琼脂凝固后，用直径3mm 的打孔器打成梅花形孔，使孔间距为4～5mm。
外周每个孔中依次加入上述稀释好的抗血清15 μl，中间孔加入BSA15μl。
将其于湿盒中放置24小时。
2.结果2. 1 免疫血清制备结果[3]制备所得的血清淡黄色，透明，总共得40ml血清。
离心后弃去一部分，大约有35ml。
图1 .双向琼脂扩散试验鉴定抗血清效价（注：1:1、1:2、1:4、1:8、1:16为倍比稀释的抗血清；NS 为生理盐水，为阴性对照；BSA 为牛血清，浓度为5ml/L ）如图所示，得到的血清通过双向免疫扩散试验，在抗原和1：8抗体之间出现一条沉淀线，所以双向琼脂扩散试验鉴定抗血清效价为1:8。
3.讨论1.免疫电泳技术是将琼脂电泳与免疫扩散相结合的-种常用的免疫学实验方法，由Crabar 与Williams 于1953年创立，此项技术由于具有抗原抗体反应的高度特异性，电泳分离技术的快速，灵敏和高分辨力，以及实验设备和操作简便等优点，至今仍作为免疫学的一种基本技术，广泛用于科学研究和临床实验诊断。
数十年来，根据不同的实验目的和要求，在经典的免疫电泳技术基础上，又衍生出对流免疫电泳、火箭电泳、交叉免疫电泳及免疫固定电极等许多新技术和新方法出现。
免疫电泳(immunoelectrophoresis ，IEP)是将区带电泳与双向免疫扩散相结合的一种免疫化学分析技术。
先将蛋白质抗原在琼脂平板上进行电泳，使不同的抗原成分因所带电荷、分子量及构型不同，电泳迁移率各异而彼此分离。
然后在与电泳方向平行的琼脂槽内加入相应抗体进行双向免疫分散。
分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀线。
根据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的标准(或正常)抗原抗体形成的沉淀线比较，即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。
双向免疫扩散可根据沉淀线的位置、数量、形状以及对比关系，对抗原或抗体进行定性分析，常用于抗原和抗体的纯度鉴定以及抗体效价测定。
该方法简便易行，结果稳定可靠，临床曾用于诊断和分析某些疾病，如检测AFP 、HBsAg 等。
对流免疫电泳可用于 NS 1:1 〇 〇 1:16 〇 〇 〇1:2 〇╲╱ 〇 1:8 1:4抗原的半定量测定，或根据沉淀线的位置、形状做抗原抗体相对浓度分析。
结果证明，BSA用于免疫学沉淀反应试验可取得较高的抗血清效价。
助于我们科研素质的培养，加强我们对免疫学的系统性学习，提高我们自主完成实验的能力。
[4] 2.多克隆抗体的特异性、效价与免疫原性质及免疫动物的种类与方式密切相关。
实验过程中也有出现家兔死亡的现象，这与家兔个体本身的情况有关。
双向免疫扩散敏感度较低，试验所需时间较长，只能定性，不能定量，仅适用于大量普查项目。
例如可用于检测未知Ag或Ab、Ag性质分析、Ab效价滴定、Ag或Ab纯度鉴定等。
[5]3.双向免疫扩散实验中应注意：a.玻片要清洁，边缘无破损 b.浇制琼脂板：均匀、无气泡 c.打孔时要垂直且避免水平移动 d.加样时应尽量避免气泡或加至孔外，以保证结果的准确性 e.37℃扩散后，放置冰箱可使沉淀线更加清晰参考文献：[1]蔡玲斐，】《医学理论与实践》2005年第18卷第3期,254-255页[2]蔡玲斐.牛血清白蛋白的抗血清在免疫学沉淀反应实验中的应用[J].医学理论与实践, 2005,18(3)254-255.[3]徐军发主编.临床免疫学检验实验[M].科学出版社 ,2010 ,19-21.[4]蔡玲斐，医学理论与实践, The Journal of Medical Theory and Practice, 编辑部邮箱2005年03期[5]吕世静主编.临床免疫学检验[M].中国医药科技出版社, 2010, 18-28.。