（本科）生物科学专业分子生物学实验2013年制订课程代码：学分：1总学时：17先修课程：《生物化学》，《有机化学》等。
开课对象：生物科学专业（本科）一、课程的性质、目的与任务分子生物学已成为生命科学的基础学科之一，其基本理论和实验技术已渗透到生物学的各个领域并促进了一批新学科的兴起和发展。
目前，以分子生物学为基础的基因克隆重组技术已成为现代生物技术的核心。
为了适应分子生物学技术的发展，落实培养创新人才的目标，特开展本实验课程，以培养学生的动手能力，加强学生对分子生物学实验技术的理解。
除了增进对分子生物学内容的理解，更重要的是培养学生的实验技能和创新思维设计。
通过实验原理的讲解和实验操作，使学生初步了解和熟悉现代分子生物学实验的基本原理、操作机能和实际应用，提高学生的创新思维和独立分析问题解决问题的能力。
二、实验内容与学时分配实验一实验器材清洁灭菌与试剂配制一、学习分子生物学实验室规则与注意事项二、熟悉相关仪器的使用及操作规程超净工作台、PCR仪、电泳仪及电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴锅、恒温培养箱、摇床、冷冻离心机、涡旋振荡器、高压蒸汽灭菌锅、微波炉、重蒸水装置、移液枪三、器材的清洁与包装消毒（每组一份）1.试管清洗与包装灭菌：用清洁液刷洗后自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗两遍，晾干或烘干使用。
取棉花与纱布，制成棉塞，塞好试管口。
3只一组用报纸包裹、细绳扎紧，高温蒸汽灭菌。
2.培养皿清洗与包装灭菌：将培养皿清洗干净，晾干或烘干，盖好，4套一组用报纸包裹，灭菌。
3.离心管的包装与灭菌：将100ml烧杯清洗干净，晾干或烘干。
取1.5ml及10ml 离心管装入烧杯中，包口灭菌。
4.枪头的灭菌：将10ul、200 ul和1000 ul枪头装入配套的枪头盒，包好灭菌。
5.清洗250ml、100ml和蓝口瓶盖盖。
装好灭菌。
6.灭菌完毕后取出烘干或晾干，保存备用。
四、试剂的配制与灭菌：1. LB培养基：酵母提取物 5g；蛋白胨 10g；NaCl 5g；琼脂 15～20g；定容至1000mL（NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌）。
有时需在培养基中添加抗生素，琼脂凝固点为40℃，所以添加抗生素最好在50～55℃。
2.电泳缓冲液：50×TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA （pH 8.0）配制1000 mlTris 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TAE缓冲液的配制：称量20 ml的50×TAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。
溴化乙锭贮存液：10 mg/ml 溴化乙啶配制：100 ml称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。
将溶液定容至100 ml后，转移到棕色瓶中。
室温保存。
6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。
配制：10 ml溴酚蓝 25 mg二甲苯青FF 25 mg甘油 3 ml用6×TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。
-20℃保存。
其它试剂：DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖3. 0.05mol/l CaCl2溶液：称取0.37g CaCl2·2H2O，溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。
4. 含15%甘油的0.05mol/l CaCl2：称取0.37g CaCl2·2H2O，溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。
5. 取锥形瓶装好双蒸水，包口、灭菌，即无菌水，存放于室温。
6.用脱脂棉制成棉球，配制75%酒精浸泡，置于广口试剂瓶中备用。
实验二 PCR扩增目的DNA及电泳鉴定一、实验目的：掌握PCR技术的原理、方法和实验注意事项二、实验原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。
DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。
在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
三、实验用品PCR仪、台式离心机、电泳装置与凝胶成像系统、移液枪、PCR管、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、一对引物、无菌水、模板（DNA或cDNA）四、实验步骤在一灭菌的0.2ml PCR管中加入：2µl RT产物2.5µl 10×Buffer(终浓度为1.5mM)1.5µl 25mM MgCl20.5µl 10mM dNTPs (终浓度各为0.2mM)2.0µl 10µM上下游引物混合物（终浓度各为0.8µM）0.5µl 1U/µl Taq DNA聚合酶16µl灭菌双蒸水总体积为25µlPCR反应程序为94℃/5min预变性；94℃/20s变性、50℃/40s退火、72℃/40s 延伸，循环35圈；72℃/10min再延伸。
反应结束后，取5μL扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析。
实验三核酸的琼脂糖凝胶电泳与分析一、实验目的学习并掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳的原理与方法。
二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。
把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。
由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。
具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。
凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。
在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。
相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。
在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。
一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。
本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。
三、实验用品1.仪器及耗材：水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、移液枪及配套枪头、点样板或保鲜膜、一次性手套、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒等。
2.试剂及配制：50×TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）配制1000 mlTris 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TAE缓冲液的配制：称量20 ml的50×TAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。
溴化乙锭贮存液：10 mg/ml 溴化乙啶配制：100 ml称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。
将溶液定容至100 ml后，转移到棕色瓶中。
室温保存。
6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。
配制：10 ml溴酚蓝 25 mg二甲苯青FF 25 mg甘油 3 ml用6×TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。
-20℃保存。
其它试剂：DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖四、实验方法1. 制备1％琼脂糖凝胶(50ml)：称取0.5 g琼脂糖置于锥形瓶中，加入50ml1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。
微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。
2. 胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾干，放入制胶玻璃板。
取少量琼脂糖凝胶液将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。
将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。
将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。
室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中。
添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。
3. 加样：在保鲜膜上混合8.3μl质粒DNA样品和1.7μl上样缓冲液，用10 μl移液枪分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
（注意：加样前要先记下加样的顺序）。
4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60－100V，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。
电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。
当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。
5. 电泳完毕后，取出凝胶，用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min，再用清水漂洗10 min。
6. 观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。
7. 常见问题及注意事项①.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。