分子生物学实验技术 郭秋平
DNA 序列
DNA分子一级结构中的显著特点, 顾名思义,就是脱氧核糖了。也 就是核糖的2’位上没有自由羟 基.这也就是DNA这一主要遗传 物质极其稳定的根本原因。特别 是对于碱的抵抗力,在pH11.5 时,DNA链的一级结构几乎没有 任何变化,而RNA链在几分钟内 降解为2’单磷酸核苷和3’单磷酸核 苷。RNA碱水解先生成一个2',3' 环式单核苷酸中间产物,由于是 一个五员环,稳定性较差,很快 转变成2'单核苷酸和3'单核苷酸.
分子杂交(简称杂交,hybridization)是核酸研究中一项最基本的实 验技术。其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源 不同的DNA(或RNA)片段,按碱基互补关系形成杂交双链分子 (heteroduplex)。杂交双链可以在DNA与DNA链之间,也可在RNA与 DNA链之间形成。杂交的本质就是在一定条件下使互补核酸链实现 复性(加热或碱处理)使双螺旋解开成为单链,因此,变性技术也是核酸 杂交的一个环节。
4.碱基分子内能
当由于温度等因素使碱基分子内能增加时.碱基的定向排 列遭受破坏,从而削弱碱基的氢键结合力和碱基的堆集力, 会使DNA双螺旋结构受到破坏。(如加热、高温)
三:DNA的变性
概念:指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线 性结构的现象。确切地就是维持双螺旋稳定性的氢键 和疏水键的断裂。 特点:
光吸收法.流体力学法,量热法,极谱法,
完全变性DNA即单链DNA的A260=1.37.
单核苷酸的等比例混合物的A260=1.60。 由于DNA变性而引起的光吸收的增加称为 增色效应(hyperchromicity)。 当缓慢而均 匀地(目前可以做到 0.1℃/分)增加DNA溶液 的温度,记录各个不同温度下的数值,即可 绘制成DNA的溶解曲线,如左图所示。当 A260增加到最大增值的一半时,即相当值 A260达到约1.185时,这时的温度叫做DNA 的熔解温度或熔点,用Tm表示。这是一个 鉴定DNA的非常有用和非常方便的参量。
蛋白质存在于所有 的生物细胞中,是 构成生物体最基本 的结构物质和功能 物质。 蛋白质是生命活动 的物质基础,它参 与了几乎所有的生 命活动过程。
1 蛋白质的结构组成
蛋白质是一类含氮有机化合物,除含有碳、氢、 氧外,还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有 其他一些元素,主要是磷、铁、碘、碘、锌和 铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为: • 碳 50% • 氢 7% • 氧 23% • 氮 16% • 硫 0—3% • 其他 微 量
若杂交的目的是识别靶DNA中的特异核苷酸序列,这需要牵涉到另 一项核酸操作的基本技术─探针(probe)的制备。探针是指带有某些 标记物(如放射性同位素32P,荧光物质异硫氰酸荧光素等)的特异性 核酸序列片段。若我们设法使一个核酸序列带上32P,那么它与靶序 列互补形成的杂交双链,就会带有放射性。以适当方法接受来自杂交 链的放射信号,即可对靶序列DNA的存在及其分子大小加以鉴别。 在现代分子生物学实验中,探针的制备和使用是与分子杂交相辅相成 的技术手段。核酸分子杂交作为一项基本技术,已应用于核酸结构与 功能研究的各个方面。在医学上,目前已用于多种遗传性疾病的基因 诊断(gene diagnosis),恶性肿瘤的基因分析,传染病病原体的检测等领 域中,其成果大大促进了现代医学的进步和发展。
• DNA与RNA结构相似,组成成份上略有不同
核酸的组成
核酸 核苷酸
水 解
核苷
磷酸
戊糖
碱基
核
酸
核苷酸
代表戊糖,对DNA而言为脱氧核糖, 对RNA而言为核糖; 代表碱基 代表磷酸基
DNA的一级结构
DNA的一级结构是指DNA分子中核苷酸的排 列顺序 ,DNA从结构上来说是由脱氧核糖核苷 单磷酸通过3',5磷酸二酯键连接而成的高聚 物。从同一个磷酸基的3’酯键到5’酯键的方向 定为链的方向。在大多数天然DNA分子长链 的两端,总是有一个核糖带有自由的5’磷酸, 而另一端的核糖带有自由的3'羟基,前者称为 5'端,后者称为3’端。DNA链的方向就是从5' 端到3'端。
3.茚三酮反应:可作为氨基酸定量分析方法。
• 构成蛋白质的20种氨基 酸在可见光区都没有光 吸收,但在远紫外区 (<220nm)均有光吸收。 • 在近紫外区(220-300nm) 只有酪氨酸、苯丙氨酸 和色氨酸有吸收光的能 力。 • 酪氨酸的max=275nm, 275=1.4x103; • 苯丙氨酸的max= 257nm,257=2.0x102; • 色氨酸的max=280nm, 280=5.6x103;
分子生物学实验技术
郭秋平
核酸和蛋白质的基本性质 及实验操作注意事项
蛋白质
一、核酸的基本性质
核酸:是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。核酸可 以分为脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)和核糖 核酸(ribonucleic acid,RNA)两大类。 • 核酸(DNA和RNA)是线性多聚核苷酸, 基本结构单元是核苷酸
四:离子强度
已经变性的DNA需要下列条件才能复性: (1)有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力,常用 的盐浓度为0.15至0.50mo1/L的NaCI; (2)有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键,但又不 能太高.否则配对碱基之间的氢键又难以形成的。一 般使用比Tm低20℃-25℃的温度 。
三:杂交
氨基酸的 光吸收
氨基酸的离解性质
• 氨基酸在结晶形态或在水溶液中,并不是以游离的羧 基或氨基形式存在,而是离解成两性离子。在两性离 子中,氨基是以质子化 (-NH3+) 形式存在,羧基是以离 解状态(-COO-)存在。 • 在不同的 pH 条件下,两性离子的状态也随之发生变化。
COOH H3N
+
C H R
•
碱基含有共轭双键
• 最大吸收峰260nm左右
核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示,摩尔磷即相当 于摩尔核苷酸
30.98 A P)= ( WL
ε:摩尔吸光系数 A:吸收值 W:每升溶液磷重量 L :比色杯内径
测量变性的方法:
旋光色散法,圆二色性法,层析法等。 光吸收法:DNA中的碱基的嘌呤环和嘧啶环 中的转变,在260nm有明显的吸收峰。当 DNA变性时,有序的碱基排列被打乱了,于 是增加了对光的吸收。 如当浓度都为50ug/ml时, 双螺旋DNA的 A260=1.00,
1.
2. 3.
断裂可以是部分的或全部的,
是可逆的或是非可逆的。 不涉及到其一级结构的改变。
变性能导致DNA以下一些理化及生物学性质的改变。
溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的"刚性"结构,变性后代之 以“柔软” 而松散的无规则单股线性结构,DNA粘度因此而 明显下降。 溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子 局部的构性改变, 使DNA溶液的旋光性发生变化。
增色效应或高色效应(hyperchromic effect)。指变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子具有吸收250- 280nm波长的紫外光的特性,其吸收峰值在260nm。DNA分子 中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础,但双螺旋 结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。
变性DNA 的双链解开,碱基中电子的相互作用更有利于紫外 吸收,故而产生增色效应。
二、决定双螺旋结构状态的因素
1.氢键: 在每一个碱基上都有适于形成氢键的供氢体如氨基和羟基以及受氢 体如酮基和亚氨基。 (Tm为溶解温度)
Tm=69.3十0.41(%G十C) (Marm点:特异性很强 高度的方向性
2.碱基堆集力 同一条链中的相邻碱基之间的非 特异性作用力,即疏水作用力和 Van der Waal力。
氨基酸(amino acid)是组成蛋白质的基本单位。组成人 体蛋白质的氨基酸仅有20种。
氨基酸的理化性质 1.两性解离及等电点:所有氨基酸都含有碱性的α-氨基和 酸性的α-羧基,因此氨基酸是一种两性电解质,具有两性解 离的特性。 2.紫外吸收性质 根据氨基酸的吸收光谱,含有共轭双键 的色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm波长附近。
杂交示意图
四:Cot 曲线
在核酸复性研究中,定义了一个Cot的术语,(Co为单链DNA的起始浓 度,t是以秒为单位的时间),用以表示复性速度与DNA 顺序复杂性的 关系。在探讨DNA顺序对复性速度的影响时,将温度、溶剂离子强 度、核酸片段大小等其它影响因素均予以固定,以不同程度的核酸 分子重缔合部分(在时间t时的复性率)取对数后对Cot作图,可以得到 如图所示的曲线,用非重复碱基对数表示核酸分子的复杂性。在 DNA总浓度(以核苷酸为单位)相同的情况下,片断越短,片断浓 度就越高,复性所需的时间也越短t1/2也越小 。
(1)加入能减弱疏水作用的试剂可以 消除碱基堆集作用。 (2)DNA样品加热时,碱基堆集作 用减少,同时伴随A260的增加。 (3)能够断裂氢键的试剂对于单链 DNA的碱基堆集作用没有影响.但 是将双链DNA碱基堆集作用减少到 变性DNA的程度。
3.带负电荷的磷酸基的静电斥力
正离子(如Na+) 可以中和带负电荷的磷酸基团,有效地 屏蔽了磷酸基之间的静电斥力,促进了双螺旋结构的稳 定。
影响DNA复性的因素
一:温度和时间。一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的 最佳条件, 越远离此温度,复性速度就越慢。在很低的温度(如 4℃以下)下,则不容易发生复性。 二:DNA浓度。复性的第一步是两个单链分子间的相互作用 “成核”。这一过程进行的速度与DNA浓度的平方成正比。 即溶液中DNA分子越多,相互碰撞结合“成核”的机会越大。 三:DNA顺序的复杂性。简单顺序的DNA分子,如多聚(A)和 多聚(U)这二种单链序列复性时,互补碱基的配对较易实现。
•DNA变性方法