据所测A595值，于标准曲线 上查出相当标准蛋白的量，取
三重复样品蛋白含量均值
以制作标准曲线的1号试管 做空白对照，595nm测吸光度
㈢结果计算
样品蛋白质含量=—m —(µg)—×提—取液—总—体积—（m—l）
／g鲜重﹚
所取提取液体积×样品鲜重（
m为从标准曲线查得的蛋白质含量。
﹙µg
㈣、标准比较法 取三只试管，按下表操作
试管编号 待测管（U) 标准管（S) 对照管（B)
试剂
V(样品提取液）0.1 ／ml
__
__
V（蛋白质标 —
0.1
准液)ml
V(0.9％生理 — 盐水）／ml
__
0.1
V（考马斯亮 3.0 蓝试剂）／㏕
3.0
3.0
混匀放5min
A595
调零
★样品蛋白质提取液含量m(µg)=Au／ As×100
五、注意事项
（µg／0.1ml)
20 40 60
80 100 20 0 80 100
每支试管加入3ml考马斯亮蓝试剂
振荡混合后放置5分钟
A595为纵坐标、标准蛋白含量横坐标 绘制标准曲线
于595nm测定吸光度
㈡样品提取液中蛋白质含量的测定
取3支试管，各吸蛋白提 取液0.1ml，分别加考 马斯亮蓝试剂3ml
振荡混合放置5分钟
三、实验器材与试剂
⒈器材。 可见分光光度计、试管、试管架、研钵、离心机、离心管、
10ml容量瓶、刻度移液管、移液枪、小麦叶片或绿豆下胚 轴。 ⒉试剂。 ⑴0.9％生理盐水 ⑵考马斯亮蓝试剂 称取考马斯亮蓝G250 100㎎，加95％乙醇100ml，溶解后 加85％H３ＰＯ４， 100 ml，加水稀释至 1000ml，存于棕色瓶。 ⑶蛋白质标准溶液
⒈待测液中蛋白质浓度不可过高或过低，应 控制在100~800µg／ml为宜。
⒉比色测定时，考马斯亮蓝易吸附在比色皿 表面，对后续测定造成影响，因此测定结 束后用无水乙醇清洗比色皿。
预期结果
• Brandford染色液和蛋白液在酸性条件 下结合，溶液颜色由棕黑色转为蓝色。
一、实验目的。
⒈掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原 理与方法。
⒉熟练分光光度计的使用和操作方法。
考马斯亮蓝法出现背景
•
双缩脲法和Folin—酚试剂法的
明显缺点和许多限制，促使科学家们去
寻找更好的 蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法
（Bradford法），是根据蛋白质与染料
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。
★实验缺点
（1）Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面 的偏差。
（2）标准曲线也有轻微的非线性。因而不能用Beer定律进行计 算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
准确称取经微量凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白，配置 1000µg/ml标准溶液。
四、实验步骤
㈠标准曲线的制作 取试管6只，按下表进行编号并加入试剂，充分摇匀。
试管编号
1234 Nhomakorabea56
试剂
V（标准蛋白溶液） 0
／µl
20 40 60
V(0.9％生理盐水） 100 80 60 40
／µl
Ρ(蛋白质含量）／ 0
★在595nm下测定的吸光度值，与蛋白质 浓度成正比
★实验优点
（1）灵敏度高。据估计比Lowry法约高四倍，蛋白质－染料复 合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定， 只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟 至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法 那样费时和严格地控制时间。
相结合的原理设计的。这种蛋白质测定
法具有超过其他几种方法的突出优点，
因而正在得到广泛的应用。这一方法是
目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
二、实验原理
★考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中 与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的 位置，由465nm变为595nm，溶液的颜 色也由棕红色变为蓝色。经研究认为， 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 （特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基 相结合。