考马斯亮蓝法测蛋白质含量
一、原理
考马斯亮蓝G-25(Coomassie G-250是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在 465nm 处有最大吸收值。

考马斯亮蓝 G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质一考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收入max的位置发生红移，在
595nm 处有最大吸收值。

由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在 595nm 处的光吸收远高于考马斯亮蓝在 465nm 处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。

蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。

利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。

考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在 1ug 左右。

二、操作步骤
1. 标准曲线测定法
分别取六只试管，其中一只加入 1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为 100ug/ml 牛血清清蛋白标准液，补充水到 1.0ml。

然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min,在紫外 -可见分光光度计 595nm 处测定吸光值。

以 A595 吸光值为纵坐标,牛血清清蛋白的 ug 数量为横坐标绘制标准曲线。

具体操作见下表。

蛋白质标准曲线测定加样
在标准蛋白质测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做3支平
行管。

3•试剂配置
a. 牛血清清蛋白标准液结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量或者根据牛血清清蛋白的消光系数
是6.6来计算其百分含量。

然后根据该蛋白的纯度配置成浓度为
100 ug/ml的蛋白溶液。

b. 考马斯亮兰G— 250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250,溶于
50ml 95%的乙醇后，再加入100ml 85%的磷酸，用水稀释至1升
三、数据及绘图
蛋白质标准區。