反应化合物在595nm处有最大光吸收，化合物颜色 的深浅在一定范围内与蛋白质浓度成正比，，因 此可通过测定595nm处的光吸收值来计算蛋白的含
量。
考马斯亮蓝染色法的优点： （1）灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），测 其最低蛋白质测量可达1mg。 (2)测定快速,简洁。只需加入一种试剂， 完成一个样品的测定，只需5min左右。 (3)此方法干扰物少 如干扰Lowry法的K+、 Na+、Mg+例子，Tris缓冲液、蔗糖、甘油、 EDTA等均不干扰此法。
6、根据标准曲线计算待测蛋白浓度
在标准曲线上，根据测出的待测样品的
A595值，查处试管中蛋白质浓度，再按 照计算公式： 待测蛋白质的浓度（mg/mL）=查出的浓 度×稀释倍数 计算出待测蛋白浓度，如样品稀释合理 且操作得当，待测蛋白的三个数值应具 有同一性，取其平均值作为待测蛋白浓 度，如某一吸收值落在标准曲线线性范 围外，舍弃该点。
微量进样器按下表操作，将待测蛋白
配成系列浓度。
管号 8 9
待测蛋 缓冲液 总体积 稀释倍 白质 数 （μ L ） （μ L ） （μ L ） 20 40 80 60 100 100 5 2.5
10
60
40
100
1.67
3、加入G250试剂
各试管充分混匀后，用取
样器分别加入5.0mL考马 斯亮蓝G250试剂，每加完 一管，立即混合。
2.仍然有一些物质干扰此法的测定。主要干扰物质有：
三、试剂和器材
1、试剂 （1） 考马斯亮蓝G250染料试剂 考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入120 ml 85%磷酸，用蒸馏 水稀释至1000 ml。 （2） 标准蛋白质溶液 称取BSA50mg，以0.015mol/L的PBS溶液 50mL溶解，配制成1.0mg/mL的标准蛋白质溶 液，4℃存放。
4、比色
各管室温静置2-5min后，在分光光
度计上测定595nm处的光吸收值 A595，空白对照为1号试管，标准 和待测蛋白同时比色。 注意：不可使用石英比色皿，只能 用玻璃比色皿，使用后立即用少量 95%乙醇润洗，洗去颜色。
5、制作标准曲线
以标准蛋白质浓度（mg/mL）为横坐标，
吸光度A595为纵坐标作图，得到一条 标准曲线。
七.补充
蛋白质含量测定方法比较
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最
常用、最基本的分析方法之一。目前常用 的有四种古老的经典方法，即定氮法，双 缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法 （Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种 近十年才普遍使用起来的新的测定法，即 考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中 Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外 吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100 倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确， 往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法 的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任
何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为 一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可 能得出四种不同的结果。每种测定法都不 是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方 法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏 度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中 存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突 出的优点，正得到越来越广泛的应用。
思考题 1.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理 是什么？ 2.为什么不能用试管刷来清洗比色皿？ 3.能否将卫生纸塞入比色皿中吸干余液？
考马斯亮蓝染色法的缺点：
1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含
量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的
偏差。在制作曲线时通常选用G-球蛋白为标准蛋白质，
以减少这方面的偏差。
去污剂Triton X-100, SDS和 0.1mol/L的NaOH 3.标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律 进行计算，而只能用标准曲线来测定蛋白质的浓度
五.计算 六.注意事项

1. 蛋白质反应液应该储存在棕色瓶内，可长 期使用，但如果变为绿色，则需要重配 2.比色皿只能用自来水冲洗，蒸馏水、95%乙 醇润洗，不可用试管刷或者其他物品直接 洗刷。 3.玻璃比色皿1套只有4只，可以同时使用， 严禁与其他比色皿混用。 4.分光光度计的吸光值在0.2-0.7时准确度最 高，低于0.1而超出0.1时误差较大，如未 知样品的读数不在此范围内，应将样品做 适当稀释或浓缩。
管号 1 2 3 4 5 6 7
标准蛋白 缓冲液 总体积 质（μ L） （μ L） （μ L） 0 10 20 40 60 80 100 100 90 80 60 40 20 0 100 100 100 100 100 100 100
2、将待测蛋白配成合适浓度
另取3支清洁试管，编号8、9、10，用
由于每种蛋白质与该染料的结合能力不同，故标准 品的选择非常重要，选择尽可能与待测蛋白一致的 样品做标准，能最大限度的提高该方法的准确性。

考马斯亮蓝G250有红蓝两种不同颜色的形式。在
一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的
溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反 应迅速而稳定。经研究证明，染料主要是蛋白质 中碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基相结合。
2．器材
（1）取样器及其架子 （2）试管及试管架
（3）漩涡混合器
（4）微量进样器
（5）VIS-7220可见分光光度计
四、操作方法
1、标准曲线的制作
（1）取7支试管，1号管为空白，2-7 号用微量进样器分别加1.0mg/mL的牛 血清白蛋白溶液10，20，40，60，80， 100μ L，各管用0.015mol/LPBS缓冲 液补充剂100μ L，详见下表，混匀待 用
蛋白质含量的测定
——考马斯亮蓝染色法 （ Bradford 法）
一、实验目的
掌握Brodford法测量蛋白质浓度的原理 和操作技术。
二、实验原理

考马斯亮蓝法是根据蛋白质与染料相结合的原理
设计的，这是一种迅速，可靠的通过染色法测定溶 液中蛋白质浓度的方法。
尽管相对于其他方法来说，此法的干扰物较少，但