蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法
[实验目的]
学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法
[实验原理]
（蓝色）变为氨基酸芳香族
碱性
染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ−−→−+
-
[器材与试剂]
器材
722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂
1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]
标准方法
1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重) =
）
测定时提取液体积（）样品重（）
提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μ
SDS 干扰实验
1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]
（一）标准方法的数据和图
表1 考马斯亮蓝标准法实验表格
根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
图1 考马斯亮蓝标准法
根据线性拟合公式y=a x+b计算所测溶液的蛋白质的含量。
（二）SDS干扰数据和图
表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格
根据表2，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。
图2 考马斯亮蓝SDS干扰实验
理论上，十二烷基硫酸钠(SDS)对考马斯亮蓝法测蛋白质含量有干扰，随着SDS浓度的增加，其混合液的595nm处的吸收峰逐渐降低，而后有一小段回升，最后趋于渐近线。
[结论]：
1．考马斯亮蓝标准法测得未知溶液中蛋白质含量为x mg/ml。
2．干扰考马斯亮蓝方法的物质中，SDS的干扰分析情况。
[干扰实验结果分析]：
当溶液中存在一定量的SDS后所测得的吸光度比正常值相对减小。
但是随着SDS 浓度的增加，吸光度的减小量应没有呈现出很明显的规律。
从SDS与蛋白质的作用机理来看，SDS可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构。
SDS 和蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。
由于SDS 的存在，阻碍了染料与碱性氨基酸和芳香族氨基酸的结合，使得吸光度减小。
由于SDS与染料分子对蛋白质的竞争结合，使得显色减弱，吸光度值降低，因此在曲线前段呈下降趋势；
但由于SDS破坏氢键，使得蛋白质的空间结构更加伸展，一些原来包裹在结构中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出来，所以会有少量的吸光度回升；但最终SDS与蛋白质的结合达到所处溶液条件下的“饱和”时，过量的SDS就不起作用了，曲线是最后为平缓段。
要去除SDS的干扰，可以利用它与K+结合生成沉淀的性质将其去除。
K+对考马斯亮蓝方法不产生干扰。
[思考与讨论]
1.用考马斯亮蓝法G-250测定蛋白质含量有何特点，操作过程中应注意什么？
答：Bradford 法的优点是（1）灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达1μg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化很大。
（2）测定快速、简便、只需要加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5min左右，颜色在5min至20min之间稳定性也很好。
（3）干扰物质相对其它方法少。
缺点是（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。
（2）仍有些物质干扰此法测定：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1mol/L的NaOH。
（3）标准曲线也有轻微的非线性。
操作注意事项：不可使用石英比色皿，可用塑料或者玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。
塑料比色皿决不可以用乙醇或丙酮长时间浸泡。
2.考马斯亮蓝G-250和R-250各有何特点，在电泳染色方面有何异同？
答：考马斯亮蓝G-250和R-250的结构式不同，配方不同，染色方法也适合于不同性质的蛋白。
考马斯亮蓝R-250即三苯基甲烷。
每个分子含有两个-SO3H，偏酸性，与蛋白质的碱性集团结合。
在一定pH时，染料—蛋白复合物可以被完全解聚。
与不同蛋白结合呈现基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内(15-20μg)，扫描峰的面积与蛋白量有线性关系。
通常用先固定，再进行染色和脱色的方法。
考马斯亮蓝G-250即二甲花青亮蓝，其染色方法经常是对蛋白质同时进行固定和染色。
这种方法的特点是快而简便，有时甚至不需脱色。
但灵敏度略逊于R-250。
同时考马斯亮蓝G-250对小肽染色效果很好。
3.试述几种主要干扰物质对考马斯亮蓝G-250蛋白测定法测定结果的影响及其作用机理。
答：SDS的存在会使相同条件下的吸光度值减小，其作用机理为：断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构。
SDS和蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。
由于SDS与染料分子与蛋白质的竞争结合，会使显色减弱，所以吸光度值减小。
Tris，乙酸，2-巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX-100，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
4.说明各种蛋白质含量测定法中哪几种可以测出蛋白质的绝对含量，哪几种只能测定其相对含量，为什么？
答：严格地讲，只有凯氏定氮法可以测定蛋白质的绝对含量，因为每6.25蛋白质含1g氮，所以，通过氮含量的测定，可以得到蛋白质的绝对含量。
其他的几种方法，由于都使用了标准蛋白制作标准曲线，所以，所测得的未知蛋白的含量，都是相对于标准蛋白含量而言的。
参考资料：
[1] 王德利等.食品中蛋白质的快速消化简便测定法.黑龙江八一农垦大学学报. 15（4）：80～82
[2]余冰宾.生物化学实验指导.清华大学出版社.2004
[3] 南亚,李宏高.考马斯亮蓝G-250法快速测定牛乳中的蛋白质.检测与分析.2007.10(12)：42～42
[4]黄婉玉等.考马斯亮蓝法测定果汁中蛋白质的含量.食品与发酵工业.2009.35(5) ：160～163
[5] 郭敏亮,姜涌明.考马斯亮蓝显色液组分对蛋白质测定的影响. 生物化学与生物物理进展.1996.23(6) ：558～561
[6]中国知网
/。