3.2生物药物目的基因的获得
问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物 的目的基因，为什么不能进行直接分离？ 一、逆转录法
逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转 录成cDNA，然后进行cDNA 克隆表达。 一）逆转录法的基本过程 1、mRNA purification
a.细胞内RNA的组成和含量：DNA:95%核内，5％
AAAAA TTTTTT
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100mM NaCl
10mM Tris 1mM EDTA
Total RNA
洗脱 rRNA/tRNA
纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图
Poly(A)mRNA
2、cDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使 oligo(dT)选出的mRNA有5-30%被拷贝。 3、cDNA第二链的合成： 4、cDNA cloning：expression vector pUC 5、将重组体导入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 （限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因 测序、确定基因的转录方向、起始点等。）
第三章 基因工程制药
教学目标：掌握基因工程制备生物药物的基本原理、基本技术。 教学要求：了解基因工程的概念、基本操作过程和主要用途；理解基因 工程制药的特点和基因工程药物主要种类；掌握基因工程药物生产的基 本过程，掌握生物药物目的基因的获得方法，掌握药物目的基因的表达 方法，掌握基因工程菌的发酵方法及重组蛋白的分离纯化方法。 教学重点：生物药物目的基因的获得方法、药物目的基因的表达策略、 基因工程菌的稳定性及重组药物的分离纯化。 教学难点：逆转录法获得药物目的基因、高水平表达策略、产物表达形 式的选择、重组药物的分离纯化。
19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学
20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因学
1944年 艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质DNA 分子遗传学
1953年 沃森--克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学
1973年 伯格--杰克森--考恩--鲍耶 DNA分子体外拼接 基因工程
四、基因工程的基本定义与用途
二）反转录人工合成互补DNA
➢ cDNA法选择性地克隆 蛋白编码序列；
➢ cDNA法克隆的目的基 因很“纯净”； cDNA片一般只有2-3kb 或更小。
三）以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆
1．获得目的基因和质粒载体；
2．形成重组质粒； 3．制备感受态细胞，用重组质粒
转化大肠杆菌细胞； 4．培养大肠杆菌，让重组质粒及
在多克隆位点插入外源目的基因， 破坏了lacZ基因的结构，大肠杆 菌形成白色的克隆
pUC18 还 携 带 了 氨 苄 青 霉 素 抗性基因，可筛选重组质粒。
一般克隆基因的检查和鉴定方法
酶切和电泳方法
外源目的基因形成大量拷贝； 5．筛选含重组质粒的大肠杆菌细
胞，进行检查或鉴定。
利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒
pUC118质粒的多克隆位点整 合 在 lacZ 基 因 中 ， 该 位 点 如 果 没 有 插 入 外 源 目 的 基 因 ， lacZ 基 因 便可表达出半乳糖苷酶，如果平 板培养基中含有 IPTG和X-gal， X-gal便会被半乳糖苷酶水解成 兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。
产物分离、纯化 产品加工、检验等
上游阶段
首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和 连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并 转入大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大 量复制目的基因。
选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功 能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化 的难易。
下游阶段
将实验室成果产业化、商品化，主要包括工 程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应 器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯 化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传 感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算 机的优化控制等。
五、基因工程药物的主要种类
1、免疫性蛋白：如各种抗原和单克隆抗体； 2、细胞因子：如各种干扰素、白细胞介素、集落刺 激因子、表皮生长因子、凝血因子； 3、激素：如胰岛素、生长激素、心钠素； 4、酶类：如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维 蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。
六、基因工程药物生产基本过程 获得目的基因 构建重组质粒 构建基因工程菌（或细胞） 培养工程菌
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
七、基因工程技术生产药物的优点
1、可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽， 为临床使用提供有效保障； 2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、 生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用 范围； 3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 4、内源生理活性物质作为药物使用时存在的不足之处， 可以通过基因工程进行改造和去除; 5、利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选 来源。
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计 与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部 分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的 设计与构建技术（即重组DNA技术）；而下 游技术则指基因工程菌或细胞的大规模培养技 术及目的基因产物的分离纯化技术。
基因工程的基本用途
✓分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信 息资源。 ✓设计、构建生物的新性状甚至新物种。 ✓大规模生产生物活性物质。
细胞器；RNA：75％细胞质，10%核内，15%细胞器 rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5%
b.真核细胞mRNA 的特点及分离纯化方法
3’-polyA（20-250AAA）-oligo(dT)
Oligo(dT) 纤维素
Poly(A)--Oligo(dT)
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Contents of chapter 3
Go 1、基因工程药物生产的基本过程 Go 2、生物药物目的基因的获得 Go 3、药物目的基因的表达 Go 4、基因工程菌的稳定性 Go 5、基因工程菌的发酵工艺 Go 6、基因工程药物的分离纯化
3.1 基因工程药物生产的基本过程
一、重组DNA技术的理论基础