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第二节
重组DNA技术的基本过程
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基本过程
（1）获得目的基因； （2）构建DNA重组体； （3）将重组体导入宿主细胞； （4）工程菌的克隆与鉴定； （ 5 ） 目 的 基 因 扩 增 与 蛋 白 表 达 。
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重组DNA技术的特点：
1 不受亲缘关系的限制，打破物种界限； 2 定向地改变物种的遗传特性； 3 增加目的基因的含量，提高基因产物的水平。
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回文序列
A palindromic sequence is a nucleic acid sequence (DNA or RNA) that is the same whether read 5' (five-prime) to 3' (three-prime) on one strand or 5' to 3' on the complementary strand with which it forms a double helix
真核细胞中单拷贝基因只是染色体DNA中的很小 一部分，从染色体中直接分离纯化目的基因难度很 大。而且真核基因含有内含子，即使将其导入了原 核细胞，由于缺乏相应的细胞器对mRNA进行加工， 也不能对其进行克隆。
获得方法
反转录法 化学合成法
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反转录法 先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进
段分别克隆进载体，再对带有外源DNA片段的重组克隆进 行鉴定、分离，再培养和进一A ① mRNA的分离 ② cDNA第一链的合成 ③ cDNA第二链的合成 ④ cDNA与载体连接 ⑤ 转染或转化 ⑥ 筛选目的克隆
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真核目的基因的获得
基因工程 将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基 因能够在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作过程。
基因工程药物 采用基因工程的技术方法，利用细菌、酵母或哺乳动物
细胞作为活性宿主，所生产的作为治疗、诊断等用途的多 肽和蛋白质类药物称为基因工程药物。
5
基因工程药物通常分为4类： 激素和多肽类、酶、重组疫苗、单克隆抗体
为模板，由引物起始从5’→3’延伸。
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PCR
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目的基因的表达
目的基因所携带的遗传信息，经过极其复杂的 生物化学反应，最终产生具有生物功能的蛋白质 的过程。
宿主细胞
原核细胞 eg. 大肠杆菌，枯草芽 孢杆菌，链霉菌等
真核细胞 eg. 酵母菌、丝状真菌、 哺乳动物细胞等
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宿主细胞显微镜下照片
体载体、病毒载体、以及由它们相互组合或与其他 基因组DNA组合成的载体
5'- G A A T T C -3' 3'- C T T A A G -5'
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粘性末端
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连接酶：将两端乃至数段DNA片段拼接起来的酶。 具有分子“缝合”作用。可催化DNA片段的5’磷酸
基与3’羧基之间形成磷酸二酯键，连接时需要ATP作 为辅助因子。
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其他工具酶： DNA聚合酶，反转录酶，T4 多核苷酸激酶，碱性
行cDNA 序 列 或 多 肽 的 一 般 结 构 时 ， 如 链 长 在
60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。
2020
PCR法或逆转录PCR（RT-PCR）
典型PCR反应包括：
①模板变性 94℃以上(1～2’) ②退 火 50～55℃(1～2’) ③延 伸 72℃ (1～2’) 在高温聚合酶作用下，以DNA单链
第三章 基因工程制药技术
1
第一节 概述
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精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
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质粒DNA
酶切
外源DNA
酶切
质粒
引入受体
染色体
由细胞分裂 来增殖
基因工程操作过程模式图
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基因的表达系统：
原核生物系统 真核生物系统
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基因表达系统的选择： 1、要保证所表达蛋白的功能； 2、蛋白表达量的多少和分离纯化的难易。
1515
原核目的基因的获得基因组DNA的建立 用限制性内切酶对细胞总DNA酶解，然后把这些酶解的DNA片
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第三节
基因工程工具酶和克隆载体
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基因工程的常用酶
基因工程的操作依赖一些工具酶对基因进行人工切 割和拼接等操作。
限制性内切酶 连接酶 修饰酶
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识别和切割双链DNA分子内特殊的核苷酸序列的 NDA水解酶称为限制性内切酶。
Ⅱ类限制性内切酶的主要作用是切割DNA分子，便 于对含有特定基因的DNA片段进行分离和分析，是 基因工程中使用的主要的工具酶。
人胰岛素（Insulin）
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3D Structure of Insulin
胰岛素二聚体 （ dimer） 胰岛素六聚体（hexamer ）
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基因工程制药的发展
美国是应用现代生物技术研制新型药物最多的国家， 其基因工程药物的研发也处于世界先进水平。
1971年，第一家生物制药公司Cetus在美国成立。 目前美国已经有1300多家生物技术公司.
1982~1998年的16年时间里，已经有53种基因工程 药物获得FDA批准上市，广泛应用于治疗癌症、多发性硬 化症、糖尿病、肝炎及一些罕见的遗传性疾病。
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我国基因工程发展的现状 第一个在我国生产的基因工程药物 ——重组人干扰素α1b 第一个采用中国人基因克隆和表达的基因工程药物。 目前我国已有15中基因工程药物和若干种疫苗批准上市。
磷酸酶等。
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克隆载体
外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌 和动物受体细胞，这种能承载DNA片段并带入受体 细胞的传递者称为基因工程载体。
基本条件：1.能够进入宿主细胞；2.可以在宿主细 胞中独立复制；3.有筛选标记；4.有单一或较少的 酶切位点。
分为三大类：1.克隆载体 2.穿梭载体 3.表达载体 目前已构建应用的基因工程载体：质粒载体、噬菌