第七章色谱分离技术凝胶筛分
常规的色层分离
色层分离过程包含两部分： 固定相：载体或载体+功能基团 流动相（洗脱液）：缓冲液或有机溶剂
对于高压液相色谱和低压层析，操作模式有很 大区别。
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上样 洗脱
上样 冲洗 洗脱
高压液相色谱 分离操作过程
层析分离操作过程
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N (tR )2
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色谱流出曲线及参数
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容量因子k 和平衡常数K 某物质的k定义为在分配平衡时该物质在两
相中绝对量之比。
k'
物质在固定相的(q量 s ) 物质在流动相的(q量 m)
而平衡常数K为平衡时，物质在两相的浓度比：
K
物质在固定相的(浓 qs /度 Vs) 物质在流动相的浓qm度/V（ m)
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分离原理： 含有不同分子大小的样品进入色谱柱（层析
柱）后，较大的分子不能通过孔道扩散进入填料 颗粒（凝胶珠体）内部，而与流动相一起先流出 色谱柱（层析柱）。较小的分子可通过部分孔道、 更小的分子可通过任意孔道扩散进入颗粒（珠体） 内部。这种颗粒内部扩散的结果，使小分子沿柱 流动的速度减慢，使混合样品中不同的分子按分 子大小的顺序流出色谱柱（层析柱）从而达到分 离的目的。
用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使 用要求的产品。
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色层分离原理
当两相作相对移动时，利用溶质在互不相溶的 两相中吸附或分配的差异，引起移动速度的不 同而进行分离的方法。
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分类
流动相与固定相：
流动相：可为气相、液相、超临界流体等 固定相：固体、液体和以固体为载体的液体薄层
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第七章色谱分离技术凝胶筛分
液相色谱的基本原理和参数
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保留时间(tR)和保留体积(VR)
从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所
需的时间为保留时间，用tR表示。在这段时间
内冲洗剂（流动相）
VR tR•F
流过的体积为保留体积，用VR 表示。
理论塔板数的计算公式为：
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凝胶过滤介质：良好的凝胶过滤介质应满足如 下要求：
（1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任 何化学或物理相互作用； 蛋白质的分级和除盐效果只与溶质的相对分子量、
分子形状和凝胶结构（孔径分布）有关，与所用洗脱液 的pH值和离子强度等物性无关。 （2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试
剂中保持稳定，使用寿命长； （3）具有一定的孔径分布范围； （4）机械强度高，允许较高的操作压力。
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常用的分离介质
天然及高分子介质 经常使用的是葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼
脂糖（Sepharose）、琼脂糖与葡聚糖接枝而成 的复合凝胶（Superdex）以及聚丙烯酰胺类和聚 乙烯醇类合成凝胶（TSKgel）。
前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移
动速度(u b )总是小于流动相的移动速度(u m )，而等于流
动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时
间分数之积：
ub um(11k')
而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移 动速度与它们通过柱子所花费的时间成反比：
ub
t
o R
um tR
理论塔板高度H 为： 式中， L 柱长。
HL N
塔板高度论塔板高度（ H）随填料粒度减少而减少； 2）在一定范围内流速减小有利于提高柱效； 3）减少冲洗剂粘度或提高柱温有利于 H减小； 4）分子量较小的样品分子 H较小。
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固定相的形状：
纸层析 薄层层析 柱层析
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操作压力
低压：﹤0.5 MPa 中压：0.5-4.0 MPa
用于大量制备
高压：4.0-40 MPa，用于分析目的
分离操作模式
洗脱展开：最常用 前沿（迎头）分析 顶替展开
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分配机理
根据溶质和固定相间的作用机理 凝胶过滤 离子交换 反相色谱 疏水层析 亲和色谱
凝胶过滤层析（体积排阻色谱）
Gel filtration chromatography,GFC Size exclusion chromatograpy，SEC
是一种纯粹按照溶质分子在溶液中的体积大 小进行分离的层析技术。
应用：主要用于蛋白质等生物大分子的分级分离 和除盐。一般用作原料液的初分离，获取 几个不同分子量物质分级，供进一步分离 纯化使用。
tR tR 0 ( 1 k ')
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当柱外死体积可忽略不计时， VR0 Vm
VRVmVm k'VmKsV
k'tR 1tR tR 0tR '
tR 0
tR 0 tR 0
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选择性( ' )和相对保留值()
=
t
' R
2
t
' R
1
' = tR2 1 k'(2)
tR1 1 k'(1)
柱效率： 塔板高度（H）和塔板数（N）是衡量色谱柱 效率的两个重要指标。
塔板高度（H）：在某一段柱长范围内溶质在固定相和流 动相之间达到分配平衡，这段柱长就相 当于一个理论塔板的高度(HETP或H)。
理论塔板数的计算公式为：
式中为标准偏差。
N (tR )2
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Vs和Vm分别为柱内固定相和流动相所占的体
积。于是有
k' qs K Vs
qm
Vm
溶质在固定相停留的时间分数= qs k' qs qm 1k'
溶质在流动相停留的时间分数 qm 1 qs qm 1k'
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在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向
色层分离技术
色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱 分离或层析分离。
惯用法 按固定相的基质（载体）类型分类：
层析：载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维 素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、 聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操 作。
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色谱：载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、 聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，适合在高 压下使用。 也有人将层析称为色谱。