分离过程中，逐渐增加洗脱剂中高极性溶
剂的比例，开始阶段增加幅度较小
(1%,2%,3%) ， 随 后 幅 度 逐 步 增 大
(5%,10%,20%等)，通常收集20-25个流分即
可将所有成分洗脱。
34
第七章 制备色谱技术
7.3 加压液相柱色谱技术
(1)快速色谱法：约0.2MPa；
(2)低压液相色谱法：<0.5MPa；
17
第七章 制备色谱技术
(2) 健合硅胶
R Si OH + R3SiX Si O Si R R
Si OH + ROH
Si OR
Si OH + SOCl2
Si Cl
Si Cl
+
RNH2
Si NHR
Si Cl
Байду номын сангаас
+
RXMg
Si R
18
第七章 制备色谱技术
(3) 氧化铝
碱性氧化铝：其水提取液为 pH9-10，常用于碳氢化
a. 设备简单，操作方便、分离快速、灵敏度
及分辨率高；
b. 切割谱带更加方便；
c. 自动化：自动点样仪、自动程序展开仪、
薄层扫描仪、多种强制流动技术、多种联
用技术如傅立叶变换红外、拉曼、质谱等。
2
第七章 制备色谱技术
7.1.2 常规制备薄层色谱PTLC
薄层板制备
为了增大上样量，增加了吸附剂用量。
固定相：硅胶、氧化铝、纤维素、 C2 、 C18
离心力加速流动相，分离速度快，操作简单，
占用空间小，使用溶剂少，可反复使用，可进行梯
度洗脱，进样量大，一次分离量0.1-0.2g.
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第七章 制备色谱技术
不同制备TLC方法的比较
参数 PTLC OPLC 加压 CTLC 离心
流动相迁移方法 毛细作用
薄层厚度/mm
分离长度/cm
0.5-2
18
0.5-2
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第七章 制备色谱技术
进样量的影响
实验室规模的制备，轻微过载，优点：
(1)便于回收高纯度目标成分，纯度>99%；
(2)纯品几乎完全回收，回收率>95%；
(3)分离程序简单，不需要为了得到纯品进一
步分析所得到的组分。
过载：低浓度时，进样量增加使得
容量因子改变超过10％
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第七章 制备色谱技术
浓度过载和体积过载
性的基质，活性易保持；
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第七章 制备色谱技术
常规柱色谱的操作
(1)装柱：干法和湿法；
(2)上样：液体上样和拌样上样，样品带尽可
能窄；
(3)洗脱：始终保持洗脱剂液面高于柱床表面，
可梯度洗脱；
(4)流分收集：常采用固定体积收集法，结合
TLC检验；
(5)样品回收：减压蒸馏或重结晶
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第七章 制备色谱技术
与SephadexLH20有相似的效果。
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第七章 制备色谱技术
琼脂糖凝胶----D-半乳糖和3,6位脱水的L-半乳糖
连接构成的多糖链，100℃时呈液态，45 ℃下互相
连接成线性双链单环的琼脂糖，再凝聚成琼脂糖凝
胶。 与1,3-二溴异丙醇在强碱条件下反应，生成CL型 交联琼脂糖，稳定性更好，pH3-14（一般的琼脂糖 pH4.5-9.0 ）；
K不变，线性
结果可预测
K变化，非线性 结果难预测
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第七章 制备色谱技术
边缘切割与循环色谱分离 －－分离不佳时
等反相健合硅胶
支撑：玻璃板或铝箔
平均25m, 5~40 m 硅胶H、硅胶G、硅胶F254、硅胶F365、硅胶P
3
第七章 制备色谱技术
硅胶粒径范围影响：
1. 越细越均匀，分离度越高，但？
2. 粒径范围宽，分离效率低，怎么办？
------薄层厚度的渐变
薄层厚度从底部到前沿逐渐增加，这样展开剂 的速度逐渐变慢，样品谱带在展开过程中逐步富
(4) 活性炭：分离水溶性物质
吸附作用在水溶液中最强，用有机溶剂洗
脱。
对芳香族的吸附力大于脂肪族；
对大分子吸附力大于小分子；
对极性基团多的分子吸附力大于少的；
易吸附气体“中毒”，用前需活化，120℃
加热4-5小时；
20
第七章 制备色谱技术
(5) 聚酰胺：又称为锦纶或尼龙
同时具有良好的亲水性和亲脂性；
常用显色剂：
a. 硫酸：硫酸:乙醇(1:1)溶液，喷后110℃烤5
分钟，不同有机物显不同的颜色；
b. 0.05% 高锰酸钾溶液，还原性物质显黄色，
背景淡红色；
c. 酸性重铬酸钾：5%重铬酸钾浓硫酸溶液，
必要时150℃烤薄层；
d. 5% 磷钼酸乙醇溶液：喷后 120℃ 烤，还原
性物质显蓝色，再用氨气熏，背景无色。
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第七章 制备色谱技术
样品收集：
a. 切割：刮刀或与真空相连的管型刮离器；
b. 回收：极性尽可能低的溶剂洗脱，通常1g
吸附剂用 5mL 溶剂，丙酮和氯仿常用，甲
醇因溶解硅胶及其中含有的杂质不常用。
c. 4 型玻璃沙芯漏斗过滤洗脱液，再用 0.2-
0.45m滤膜过滤。
d. 硅胶的黏合剂以及荧光指示剂等杂质，可
合物的分离，从碳氢化合物中除去含氧化合物。
中性氧化铝： 5% 乙酸处理，水提取液为 pH7.5 ，适 用于醛、酮、醌、某些苷以及酸碱溶液中不稳定成 分如酯、内酯等化合物的分离。 酸性氧化铝：2MHCl溶液处理，水提取液pH为4-4.5，
适合于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分离。
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第七章 制备色谱技术
用Sephadex LH-20过滤纯化。
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第七章 制备色谱技术
常规制备TLC速度慢，效率低，如何提高？
加压 离心
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第七章 制备色谱技术
7.1.3 加压制备OPLC
弹性气垫，外压使没有气相存在，展开剂
强制流动，展开速度加快
更细的固定相颗粒、更长的薄层板
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第七章 制备色谱技术
7.1.4 离心制备CTLC
(3)中压液相色谱法：0.5～2MPa；
(4)高压液相色谱法：>2MPa；
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第七章 制备色谱技术
加压液相色谱制备分离方法的建立：
(1)采用薄层色谱确定分离条件。
对于快速和低压色谱，常用薄层色谱选择
分离条件。
硅胶薄层色谱确定正相色谱条件，反相硅
胶薄层色谱确定反相色谱条件，一般选择 Rf
不大于0.3且具有较好分离效果的展开剂。
可溶于浓盐酸、甲酸，不溶于常见溶剂；
含有丰富的酰胺基，与酚类、黄酮类、醌
类、脂肪酸类物质形成氢键；
还含有非极性脂肪链，双重保留机理；
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第七章 制备色谱技术
(6) 大孔吸附树脂：苯乙烯和丙烯酸酯
骨架结构决定树脂的极性：
非极性、弱极性----苯乙烯或二乙烯基苯聚
合而成；
中等极性----甲基丙烯酸酯；
(6)惰性溶剂：环己烷、正己烷等。
7
第七章 制备色谱技术
上样和展开
1. 先用甲醇展开一次，除去可能存在的杂质；
2. 低挥发性溶剂溶解样品会引起样品带变宽，因此
选用挥发性溶剂（己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯 等），且溶剂极性尽可能小。 3. 样品浓度以能均匀分布于吸附剂表面不析出为宜， 5-10%；
4. 带状点样，尽可能窄；如点样带太宽，可用高极
改进方法：减压、加压等
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第七章 制备色谱技术
柱色谱常用固定相
(1)硅胶：官能团和分子的几何形状，对异构
体的分离选择性远大于其他色谱方法。
烷基<卤素（F<Cl<Br<I）<醚<硝基混合物<腈<叔胺
<酯<酮<醛<醇<酚<伯胺<酰胺<羧酸<磺酸
掺杂硅胶：如硝酸银处理，对不饱和烃有好 的分离效果。1%-10%的添加剂的水或丙酮溶 液与硅胶混合，稍干后110℃干燥即可。
操作参数 展开缸类型 薄层板和 展开缸空 腔体积比 值 温度
6
蒸气相 流动相 选择性 黏度
第七章 制备色谱技术
常用溶剂
(1)电子接受体溶剂：苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮等；
(2)质子给体溶剂：异丙醇、正丁醇、甲醇、无水乙
醇等； (3)强质子给体溶剂：氯仿、冰醋酸、甲酸、水等； (4)质子受体溶剂：三乙胺、乙醚等； (5)偶极作用溶剂：二氯甲烷
价态高，交换能力强；
价态相同，原子序数大能力强；
两性物质的交换取决于物化性质和特定条件下 的离子状态；
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第七章 制备色谱技术
离子交换树脂的一般原则---选择取决于被分离物质的电荷性质；
强的使用范围宽，弱的分离生物大分子时，活
性不容易失去； 反离子，为了提高交换容量，选择结合力小的 反离子； 亲疏水性选择，一般分离大分子时，选择疏水
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第七章 制备色谱技术
(4) 干胶使用前需在 5-10 倍的去离子水中充分
溶涨，倾倒掉小颗粒，减压排气。也可用煮
沸的方法溶涨，速度快，可灭菌排气。
(5)填充均匀，无空隙和气泡；
(6)多次使用后，床体积减小或污染，可再生
处理，即用水逆向反复冲洗，再用缓冲溶液
平衡。
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第七章 制备色谱技术
(8) 离子交换树脂----阳离子交换和阴离子交换
第七章 制备色谱技术
制备色谱的特点：
最有效的制备性分离技术；
实验室规模、小批量生产、产业化制备；
不同领域产品量不一样，阐明化学结构和
生物活性，30－50mg足够，分析用标准品