食品中四环素类抗生素金标快速检测试剂条的研究张银志1,肖利文2,杨燕2,孙秀兰1,23 (1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214036;2.江南大学食品学院,江苏无锡214036)摘要 [目的]建立一种检测四环素类抗生素的新方法。
[方法]四环素通过两步衍生化后,与氨基化的BS A 上的表位氨基反应,合成T C 2BS A 偶联物。
以四环素多克隆抗体-胶体金复合物作为分析探针,四环素完全抗原作为竞争抗原,构建分析体系。
[结果]紫外吸收光谱、凝胶色谱图和红外光谱均表明人工完全抗原偶联成功。
选择柠檬酸三钠加入量1.5m l 生成的胶体金作为该试验继续合成胶体金检测探针的金溶胶。
当抗体稀释倍数为1∶100、pH 值为8.70时,金标灵敏度好。
金标试纸条检测样品中四环素的检测限量是200μg/L ,检测时间不超过15.0m in 。
与E LIS A 法检测样品作对比,采用新法的准确率达100%。
探针溶液中加入10%(V/V )保护剂后,试剂条稳定性明显提高。
[结论]该研究为四环素的快速检测提供了依据。
关键词 四环素;纳米金;检测方法中图分类号 T S207.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)27-11637-03Study of R apid Detection on T etracycline A ntibiotics in Food by U sing G old 2labeled R eagent Strip ZH ANG Yin 2zhi et al (National K ey Lab of F ood Science and T echn ology ,S outhern Y angtze University ,W uxi ,Jiangsu 214036)Abstract [Objective]T he study was to establish a new m eth od for the rapid detection on tetracycline antibiotics.[M eth od]T hrough tw o step derivatiza 2tion ,the tetracycline reacted w ith epitope am in o in am ination BS A to synthesize into T C 2BS A conjugate.W ith the com pound of tetracycline polyclonal anti 2b ody 2colloidal g old as the analysis probe and the com plete antigen of tetracycline as the com petitive antigen ,the analysis system was constructed.[Result ]Ultraviolet abs orption spectrum ,gel chrom atogram and in frared spectrum all sh owed that the artificial com plete antigen was success fully coupled.T he col 2loidal g old generated by adding 1.5m l tris odium citrate was selected as the colloidal g old s olution in the ex perim ent of continu ously synthesizing the col 2loidal g old detection probe of g old s olution.W hen the dilution multiple of antib ody was 1∶100and pH was 8.70,the sensitivity of g old labeled strip wasg ood T he detection lim it of g old 2labeled reagent strip on tetracycline in detected sam ple was 200μg/L and the detection tim e was less than 15.0m in.C om 2pared w ith result of detecting sam ples by E LIS A the accurate rate by using new m eth od was 100%.A fter 10%(V/V )protective agent was added into probe s olution ,the stability of reagent strip was im proved obviously.[C onclusion]T he study provided a base for the rapid detection on tetracycline.K ey w ords T etracycline ;Nan o 2g old ;Detection m eth od基金项目 国家质监总局立项资助项目(2007IK 136);江南大学211师资基金资助项目。
作者简介 张银志(1975-),男,陕西汉中人,工程师,从事食品安全检测方面的研究。
3通讯作者。
收稿日期 2008206230 四环素类药物是一种广谱抗菌药物[1],可直接作为一种饲料添加剂投放到饲料中,曾以价格低、抗菌谱广等优点而在养殖业、畜禽业、水生生物等领域中广泛应用[2-5]。
在欧盟,四环素类抗生素的使用量占了整个禽畜业中抗生素使用量的65%[6]。
1990年,欧盟因我国畜禽产品中抗生素残留超标而停止进口我国畜禽产品[7]。
目前关于四环素类抗生素的检测方法有酶联免疫法、薄层色谱法、毛细管电泳法、质谱连用法和高效液相色谱法等[8],但这些方法都需要大型的仪器,价格昂贵,还需要专人管理。
近年来也有进口的用于四环素检测的E LIS A 试剂盒面世,但是保存期限短,价格高,远不能满足检测需要。
笔者在前人的研究基础上[9-10],建立了用金标免疫层析检测法检测四环素类抗生素的方法,为四环素的快速检测提供了可能。
1 材料与方法1.1 材料与仪器 供试材料:A BA 2BAS 抗血清、C DI 2BS A 抗血清(江苏省苏微微生物研究所提供);氯金酸(上海化学试剂厂),950m l/L 盐酸四环素标准品(T C.HC l )(购于中国药品生物制品检定所);丁二酸酐、N2氯丁二酰亚胺(NCS )、水合肼、碳二亚胺盐酸盐E DC (S igma 公司);0.01m ol/L 羊抗鼠二抗P BS 缓冲液,pH 7.4,所用水均为无锡华晶公司超纯水;牛血清白蛋白BS A 、卵清蛋白OV A (华美公司);四环素多克隆抗体(实验室自制),纤维膜,金标垫,样品吸收垫,吸水纸。
供试仪器:UV22100紫外扫描仪(北京瑞利公司产品),磁力搅拌器(IK A 公司),冷冻离心机5840R (eppend orf 德国);微量移液器PIPET M AN (G I LS ON 法国),DE LT A 2320pH 计(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司),H 21微型混合器(上海沪西仪器厂)。
1.2 方法1.2.1 四环素完全抗原的合成[2-5]。
(1)称取20mg A BA ,溶解于2.2m l 浓度0.2m ol/L HC l 溶液中。
避光条件下缓慢滴加3.5m l 0.49m ol/L 亚硝酸钠水溶液,4℃下恒速搅拌1h 。
(2)称取27mg 四环素,溶解于10m l 0.05m ol/L 的硼酸钠溶液(pH 值8.5,溶有0.15m ol/L 的氯化钠)中。
向其中缓慢滴加1.5m l 制备好的重氮化A BA 溶液。
4℃下避光反应2h ,用H 3BO 3溶液将pH 值调至7.4。
(3)称取120mg E DC 、36mg NHS 和100mg OV A ,加入上述反应液中,室温下恒速搅拌3h 。
(4)将上述反应液转移到透析袋中,以0.01m ol/L 磷酸缓冲液透析3d ,每天换透析液3次,冷冻干燥,所得粉末保存于-20℃冰箱中备用[9]。
1.2.2 胶体金溶胶的合成[6]。
取50.0m l 氯金酸溶液(1.0×10-4g/m l )置于250m l 的锥形瓶中,在磁力搅拌的同时加热至沸腾,沸腾后迅速加入柠檬酸钠水溶液(浓度为0.01g/m l )1.50m l ,继续保持沸腾至溶液为清亮橘红色时停止加热,继续搅拌1m in 停止。
用紫外-可见光分光光度仪对金溶胶在紫外-可见光范围内(200～700nm )进行扫描,获得金溶胶紫外-可见光吸收光谱,测定最大吸收波长、吸光值和峰宽。
1.2.3 胶体金溶胶标记四环素抗体探针的制备[7]。
用Na 2C O 3溶液将金溶胶液体pH 调至9.00,取20.0m l 2.4×10-5m ol/L 的金溶胶溶液,磁力搅拌的同时,缓慢滴加10μg/m l 多克隆抗体溶液2.0m l ,静置1h 后,在4℃7500r/m in安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2008,36(27):11637-11639 责任编辑 李占东 责任校对 傅真治冷冻高速离心机中离心40m in,弃上清液,沉淀用0.5m l50.0 mg/m l BS A溶液溶解[8]。
1.2.4 四环素胶体金快速试剂条的组装[9-12]。
测试条由金标垫、硝酸纤维膜和样品吸收垫3部分组成。
将硝酸纤维素膜与金标垫、样品吸收垫依次相互叠加粘贴于试剂板上。
将制备好的金标抗体探针用微量移液器吸取5μl点于玻璃纤维滤膜上端靠近硝酸纤维膜处,自然干燥后备用。
活化处理后,微量移液器对硝酸纤维膜进行检测试剂线性包被,下端横线包被完全抗原,检测线浓度为原反应溶液;上端横线包被羊抗兔IgG,浓度为3.3mg/m l,干燥后备用。
以宽3.0 mm/条切条后备用。
1.2.5 纳米金快速试剂条的使用方法[13-14]。
将纳米金快速试剂条前端直接插入样品提取液中,或者将试纸条平放在桌面上,直接滴入4滴样品提取液。
如果样品液中含有四环素,将在C线处出现红色,表示阳性;反之,在T线处出现红色,表示阴性;如T线和C线均出现浅红色线条,表示弱阳性;如T线和C线均无颜色,则说明检测试纸条失效。