稳定性好
缺点：灵敏度低 特异性较差
核酸探针
核酸分子技术路线
靶核酸
标记、纯化
分离纯化
液相杂交 固相杂交
原位杂交
预处理
探针-靶反 应
纯化杂交体
放射性核 素检测
非放射性杂 化分子检测
限制性酶切
杂交信 号检测
（二）、印迹技术的类别及应用
1、DNA印迹技术 (Southern blotting)
GCCTAG+
GATCC G
粘端切口
同功异源酶
来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
GCCTAG +GATCGC
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相 同 ， 但 切 割 DNA 后 ， 产 生 相 同 的 粘 性 末 端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称 为配伍未端(compatible end)。
2、DNA体外连接
三、其他工具酶
1、大肠杆菌DNA聚合酶 2、耐热DNA聚合酶（Taq酶） 3、逆转录酶 4、甲基化酶：将某些限制位点甲基化，使
DNA不再被某些限制酶切割，在制备重组 DNA时用于修饰目的DNA内部的一些限制位 点，保护目的DNA。
第二节 分子克隆常用载体
克隆(clone)
来自同一、其他载体
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
载体分类：
转染 transfection 用病毒或病毒DNA感染细胞。
基因表达，尤其 是转录水平
寡核苷酸探 针 人工合成
（1）链短， 杂交时间短 （2）对单核 苷酸变化敏 感
（1）所带标 记物较少， 灵敏度较低
基因点突变 分析
常见的探针标记物
放射性核素
优点：灵敏度高 对酶促反应无影响 假阳性率低
缺点：半衰期短 易造成放射性污染
常见的探针标记物
非放射性标记物 优点：无放射性污染
标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷 酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断 是否有同源的核酸分子存在。
探针种类：
DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
基因组DNA探针
来源 克隆化的基因片 段
优点
（1）制作方法 简便，易获得 （2）不易降解 （3）标记方法 成熟
易因非特异性杂 交出现假阳性结 缺点 果
分子克隆（DNA可隆、基因克隆、重组DNA等） 。
分子克隆（DNA可隆、基因克隆、重组DNA）
一、质粒(plasmid)载体
1、基本特征： 2、类型：F、R、Col 3、命名：例 pBR322 4、 pBR322质粒载体的特点
第二节 分子克隆常用载体
二、噬菌体载体
1、一般特征：是一类细菌病毒的总称，结构 比质粒复杂，感染效率很高。
基本原理
DNA加 热变性
DNA冷却 复性
DNA/RNA 杂交
变性
复性
RNA
DNA
二、核酸分子杂交的基本分类
DNA-DNA杂交
杂交
DNA-RNA杂交
杂交的基本分类
根据杂交介质的不同
液相杂交 固相杂交 原位杂交 基因芯片技术
三、核酸分子杂交与印迹技术
（一）、核酸探针
探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标
克隆化(cloning)
获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。
技术水平： ①分子克隆(molecular clone)，即DNA 克隆 ②细胞克隆 ③个体克隆（动物或植物）
DNA克隆
视频
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质 （同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人 工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能 力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转 化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子 细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子， 也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA)
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
G CCTAG
+
GATCC G
ATCTAG+GATCTA
使用注意
二、DNA连接酶和DNA分子的体外连接
1、DNA连接酶 : 1967年首先发现，能催化2 条DNA链之间形成磷酸二酯键。
根据来源分： ①大肠杆菌 ②T4噬菌体
2、定义： 2、命名：
3、分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
4、 II 型限制酶的特点 Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
第三章 分子生物学常用 技术和基本原理
第一节 分子生物学常用工具酶
一、限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割
1、来源与作用：是原核生物中的一类防御武器，可 以将外源性DNA分子切割成大小不同的片断，而细 菌本身的DNA由于修饰酶（通常为甲基化酶）的保 护作用，免受降解。与甲基化酶共同构成细菌的限 制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。1970 年首先在流感嗜血杆菌中发现Hind Ⅲ 。
微生物诊断 应用 中药鉴定
cDNA探针 RNA的逆转录 （1）不含内 含子 （2）杂交特 异性高
制备复杂，不 易获得
基因表达
RNA探针
mRNA、病毒 RNA
（1）杂交体稳定 （2）不存在互补 双链的竞争性结 合 （3）杂交特异性 高 （4）杂交后本底 低
（1）易降解 （2）标记方法较 复杂 （3）polyA影响 杂交特异性
转导 transduction 以噬菌体为媒介，转移遗传物质。
转化 transformation 以质粒将外源性DNA引入细胞的过程。
第三节 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
一、基本原理 在DNA复性过程中，如果把不同DNA
单链分子放在同一溶液中，或把DNA与 RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链 分子之间有一定的碱基配对关系，就可以 在不同的分子之间形成杂化双链 (heteroduplex) 。