凝胶内部的通道 路程较长 移动速度较慢
相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程
凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示
二、缓冲溶液
1.作用: 在一定范围内，能够抵制 外界的酸和碱 对溶
液PH值的影响，维持PH 基本 不变。 调节缓冲剂 使用比例 的就可以制得在不同PH范围内使 用的缓冲液。 磷酸缓冲液 3.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________ , 其目的是: 利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科 学研究(活性)
3.样品的加入和洗脱
1.调液面 2.加样 3.再调液面 4.洗脱 5.收集
缓冲液 凝胶
记
①调整缓冲液面：与凝胶面平齐
②滴加透析样品：加到色谱柱的（ 顶端 ）
③样品渗入凝胶床：（ 样品完全进凝胶层）
④再调整缓冲液面洗脱：
⑤收集：待（ 红色的蛋白质 ）接近色谱柱底 端时收集
色谱柱制作成功的标志： 红色区带均匀一致的移动
H
C COOH
C C OH H N R2
R3
二肽
H2O H2O
氨基酸的结合方式:脱水缩合
H O H NH2 C C N 肽键 R1 H O H C C N 肽键 R2 H C R3 COOH
三 肽
二肽
H2O H2O
• 以此类推，由多个氨基酸分子缩合而成的含有多个 肽键的化合物，叫多肽（链状）。肽链盘曲，折叠， 形成有一定空间结构的蛋白质分子。
（1）凝胶色谱柱的制作
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两 端需用砂纸磨平。
②底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
凝胶色谱柱的制作
（2）凝胶色谱柱的装填
①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。
②凝胶的前处理：配臵凝胶悬浮液：计算并称取一定 量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成 凝胶悬浮液。 ③凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装臵固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之 间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效 果。
4、纯度鉴定（电泳）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质 的鉴定。 1、垂直板电泳装置
2、稳流稳压电泳仪； 3、微量进样器（可用微量移液器代替）
（1）、 胶板的制备： ①.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干 ②.把玻璃板在灌胶支架上固定好
聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
（A为正面，B为剖面） 1：样品胶pH6.7 2：浓缩胶pH6.7 3：分离胶pH8.9 4：电极缓冲液pH8.3 10
①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先 处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。 ②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所 带电荷的性质和分子的大小、形状。
体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了 解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。 2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电泳法分离样品的原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理 3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点： ①样品的处理 ②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
磁力搅拌器
搅拌器转子
搅拌器正在工作
（3）分离血红蛋白溶液：
用滤纸过滤，除去 脂溶性沉淀层，于 分液漏斗中静置片 刻后，分出下层的 红色透明液体。
试管中溶液层次
甲苯层（无色透明） 白色薄层固体 红色透明液体
杂质沉淀层（暗红色）
柜式离心机
2.粗分离----透析（去除分子量较小的杂质）
（1）用 透析
方法进行粗分离，透析袋由半透膜制 成， 玻璃纸、肠衣、膀胱膜 常用 。将透析袋放入 溶液中进行透析。 磷酸缓冲
（2）透析的原理是 透析袋能使小分子自由进出，而将 大分子保留在袋内 （3）透析的目的是
去除样品中分子量较小的杂质
。
透析过程动画演示
3、纯化（凝胶色谱）---去除相对分子量 较大的杂质蛋白
（2）释放血红蛋白
思考：
1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了 哪些物质？ 2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？ （使用磁力搅拌器充分搅拌） 目的分析： 使红细胞大量吸水胀裂 1. 蒸馏水的作用是______________________________。 溶解红细胞的细胞膜 2. 加入甲苯的作用是____________________________。 加速红细胞的破裂 3. 充分搅拌的目的是____________________________。
②加透析样品
注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。 2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
材料：交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液 “G”表示什么？75代表什么？ 步骤 ① 固定色谱柱 ② 计算称量凝胶 ③ ④ ⑤ 配制悬浮液 装填悬浮液 洗涤平衡 操作要求 色谱柱垂直固定在支架上 根据色谱柱体积计算凝胶用量 凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀 一次性缓慢倒入；轻轻敲打 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h
琼脂糖凝胶电泳示意图
电泳槽
迷你双垂直电泳槽
卧式电泳槽
等电聚焦多用电泳槽
9
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
（1）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于
它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。 （2）、SDS能与各种蛋白质形成蛋白原有电荷 量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳 分子的大小 迁移率完全取决于（ ）。
教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、
均匀？
如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形 成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品 分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白 质的洗脱次序，影响分离的效果。
装配好的凝胶柱
(3）样品加入与洗脱
①加样前 打开下端出口，使柱内凝 缓冲液 胶面上的（ ）缓慢下 降到与（ 凝胶面）平齐， 关闭出口
11、相关计算
①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不 存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨 基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和 羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨 基和羧基都是一个
②若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成 n-m n-m ________个肽键,脱去______个水分子，至有氨基 m 和 羧基各 ____个
思考1 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质 的何种作用，作用结果是什么被破坏？
变性、变性、空间结构
思考2 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞 核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。
本课题学习目标
实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤 红细胞的洗涤 样品处理 血红蛋白的释放 分离血红蛋白溶液 粗分离： 透析—去除样品中分子量较小的杂质 纯化：用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的
杂质
纯度鉴定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （二）操作过程
1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞 提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA 的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋 白含量丰富，便于提取血红蛋白。 2. 血液有哪些成分？ 水 分 血红蛋白 血浆 其他物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等 血细 胞 白细胞 血小板 红细胞
③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化 学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结 构
④关于蛋白质相对分子量的计算： n 个氨基酸形 成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么 由此形成的蛋白质的相对分子量为______________
n · - (n - m) · a 18
血红蛋白
一、基本概念及原理
1、凝胶色谱法
凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根 据分子量的大小分离蛋白质的方法之一，又 称分子筛层析 。 凝胶实际上是一些微小的多孔球体，例 如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙 烯酰胺、葡聚糖凝胶等
原理： 当不同的蛋白质通过凝胶时
相对分子质量较小 容易进入 相对分子质量较大 无法进入凝胶 内部的通道 只能在凝胶外部移动 路程较短 移动速度较快
2.配制: 通常由 1~2 种缓冲剂 溶解于水中配制而成。
思考：说出人体血液中缓冲对。 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3
三、 电泳---血红蛋白的分离鉴定方法
1.概念： 带电粒子在 电场作用下发生 迁移 的过程。 2.原理： 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都
具有 可解离 的基团，在一定的PH下，这些基团会带 上 正电 或 负电 。在电场的作用下，这些带电分子 会向着的与其所带电荷相反 的电极移动。电泳利用 了待分离样品中各种分子 带电性质的差异 以及分子 本身的 大小、 形状的不同，使带电分子产生不同 的 迁移速度 ，从而实现样品中各种分子的分离。
一、基础知识 (一）蛋白质 1、含量 占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的 有机物 2、组成元素 C、H、O、N 3、相对分子质量
高分子化合物
4、基本组成单位 氨基酸 5、氨基酸通式 H R
C NH2
COOH
写出氨基酸脱水缩合形成二肽示意图
6、氨基酸连接方式
脱水缩合