克隆构建
一、 PCR
1、PCR
20ul体系，4个Mix，3个回收，1个对照
H2O 10.8ul 94℃3min
KOD Buffer 2ul 94℃30s
DNTPs 2ul 5X℃30s
MgSO4 2ul 68℃Xs
Primer F 2ul 68℃10min
Primer R 2ul cycle 34
KOD 0.2ul
Plasmid 1ul
试剂确保融化完全，枪头触到表面打净，最后用白枪头反复打几次混合溶液，离心3-4s，分装20ul至PCR管。

2、加尾
0.1ul Taq 酶，加入到20ul，微弹，离心，PCR仪上放置15min。

3、回收
配中孔胶，电泳并回收试剂盒回收：熔胶后室温冷却再上柱，PW缓冲液离心过后于超净台上吹干7-9min，电泳检测回收产物。

二、连接
Solution 1 5ul
目的片段 4.5ul 16℃过夜
T-vector 0.5ul
三、转化
1、感受态细胞制备
取5ml无抗LB培养液，加入到灭菌试管中，取60-80ul新鲜菌液，37℃恒温摇床2h；取其中2.4ml倒入2.5ml EP管中，尽量保持4℃低温下12000g离心30s，
沿壁缓缓加入CaCl2溶液，冰上滑动EP管管底使菌体悬浮；
2、转化涂板
加入连接产物时边加边搅，热激时温度略微低于42℃，时间严格控制1min30s 之后冰上静置3min左右，加入300ul LB 无抗培养基，于37℃恒温箱复苏50min，涂板并37℃恒温箱过夜培养。

四、鉴定
1、质粒提取
挑去单克隆菌落，37℃过夜培养，次日提取质粒。

2、酶切鉴定
根据设计引物选择双切酶，20ul体系37℃酶切2h，电泳检测并送去测序。

3、PCR鉴定
将切出片段所属的菌液进行菌液PCR鉴定。

五、连接
1、酶切回收
将测序正确的连有中间载体的质粒进行过夜酶切，次日电泳检测并割胶回收。

2、沉淀回收
选择合适的终载体50ul体系过夜双酶切，次日进行沉淀回收并电泳检测。

3、连接终载
调节insert和vector浓度比例，进行16℃过夜连接，分为2:1和4:1 ：
insert 8ul 8ul
vector 4ul 2ul
T4 Buffer 2ul 2ul
T4 Ligase 1ul 1ul
H2O 5ul 7ul
六、转化
1、感受态细胞制备
同“三”之“1”。

2、转化涂板
同“三”之“1”。

七、鉴定
1、质粒提取
挑去单克隆菌落，37℃过夜培养，次日提取质粒。

2、酶切鉴定
根据设计引物选择双切酶，20ul体系37℃酶切2h，并电泳检测。

3、PCR鉴定
将切出片段所属的质粒作为模版进行PCR鉴定。

八、转化
1、感受态细胞制备
感受态细胞为农杆菌。

2、转化涂板
电击法将切出片段的连有终载的质粒转化农杆菌感受态细胞，并涂板于28℃恒温过夜培养。

九、鉴定
1、质粒提取
挑去单克隆菌落，37℃过夜培养，次日提取质粒。

2、转化涂板
将所提质粒转化大肠杆菌感受态细胞，并涂板过夜恒温培养。

3、质粒提取
挑去单克隆菌落，37℃过夜培养，次日提取质粒。

4、酶切鉴定
根据设计引物选择双切酶，20ul体系37℃酶切2h，并电泳检测。

5、PCR鉴定
将切出片段所属的质粒作为模版进行PCR鉴定。