2．倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影 响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混 匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。 倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以 15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干 裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去， 以免与菌落混淆而影响计数观察。 3．为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后， 应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转， 检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超 过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。
（二）倾注培养



1．操作方法： 1）、根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个 适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取 该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个 稀释度做两个平皿。 2）将凉至46℃平板计数琼脂培养基注入平皿约15mL， 并转动平皿，混合均匀。同时将平板计数琼脂培养基 倾入加有1mL稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空 白对照。 3）待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养 48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数， 即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。

二、食品的正常菌相和细菌数量

食品及原料都有正常的细菌相，它们因受多种因素的影响，其种 类和数量有很大差别。 1、鲜肉的细菌相以嗜温菌为主，其次为嗜冷菌。加工良好的鲜 肉细菌数为103个／g左右，如加工不良会达到106个／g，肉制 品的细菌数约为103—104个／g，大肠菌群MPN为10—102个／ 100g，金黄色葡萄球菌为10--102个／g。 2、鲜蛋的细菌相以革兰氏阳性球菌为主，革兰氏阴性杆菌数量 很少。 3、液体蛋晶的细菌相是革兰氏阴性菌，包括假单胞菌属、产碱 杆菌属、变形菌属和埃希氏菌属，细菌数量一般为104～106个 ／g，大肠菌群为103～105个／100g，沙门氏菌为1—100个／ g。



4．培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其 生活环境水温较低，故多采用30℃）。培养时间一般 为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱 应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重 不应超过15％。 5．为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌 菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂 培养基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置， 以便计数时作对照观察。 在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清， 可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后 菌落呈红色，易于分别。

按国家标准方法规定，即在需氧情况下， 37℃培养48h，能在 平板计数 琼脂平板上生长 的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特 殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有 条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。 因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数， 菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有 时被称为杂菌数，需氧菌数等。


3．当计数平板内的菌落数过多（即所有 稀释度均大于300时），但分布很均匀， 可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应 稀释倍数作为该平板的菌落数。


2．无菌操作： 操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃 器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器 具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应 用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。 操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无 菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每 个平板不得超过15个菌落。


3）食品中细菌数量可估测出食品腐败状况 一般认为日常食品的活菌数为104～107cfu／g。 而当活菌数达到108cfu／g则可认为处于初期腐 败阶段。例如，活的家禽，皮肤表面的细菌数 可低到1.5×103cfu／cm2。而加工后马上检测 可达3.5×104cfu／cm2。当菌落数为 107cfu/cm2时表示确已经腐败，鸡肉的细菌数 达108cfu／cm2时可有气味并变粘。 一般讲，食品中细菌数量越多，则会加速腐败 变质过程的进程，甚至可能引起食用者的不良 反应。




由于食品菌相及其优势种不同，食品的 腐败变质也具有相应的特征。有些细菌 能分解蛋白质或脂肪或碳水化合物，有 些细菌则能使食品产生色素和发光，有 的还可以使食品变粘等。
第二节 菌落总数 （GB/T4789.2-2008）

一、菌落总数的概念及卫生意义 1、菌落总数 食品检样经过处理，在一定条件下培 养后（如培养基成分、培养温度和时间、 pH、需氧性质等），所得1mL （或1g） 检样中形成菌落的总数。
菌落总数的报告




1）. 菌落数在100以内时，按“四舍五人”原则修约， 采用两位有效数字报告。 2）. 大于或等于100时，第三位数字采用“四舍五人” 原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数；也可 用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后， 采用两位有效数字。 3）. 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌 落蔓延。 4）. 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 5）. 称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。
（四）特别注意

1 不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比 （同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接 近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数 愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为 检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现 象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告 的依据。


2．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生 长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个 菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条 链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每 一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平 板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半， 而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落 数乘2代表全平板的菌落数。



3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不 应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须 经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获 得均匀稀释液。 4．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水， 有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水）， 后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护 作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行 稀释，可以采用灭菌蒸馏水。




3）. 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对 稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不 可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 4）. 若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则应按稀 释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 5）. 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌 落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。 6）. 若所有稀释度的平板菌落数均不在30~300之间， 其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或 300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
二、菌落总数的常规检验方法



菌落总数的常 规检验方法 (GB4789．22008)： 基本操作一般 包括：样品的 稀释——倾注 平皿——培养 48（24）小 时——计数报 告。
检 样 25g(或25mL)样品+225mL稀释液，均质 10倍系列稀释 选择2～3个适宜样品匀液各 取1mL分别加入无菌培养皿 每皿中加入15～20 mL平 板计数琼脂培养基，混匀


2、液体蛋晶的细菌相： 主要是革兰氏阴性菌，包括假单胞菌属、产碱 杆菌属、变形菌属和埃希氏菌属等。 3、鲜鱼的细菌相 以嗜冷菌为主，有假单胞菌属、黄色杆菌属和 弧菌属等。 如在水产品中发现了沙门氏菌，一般认为是外 来污染，应对该产品的生产，加工过程进行分 析、检测，从而找到污染源。
（三）计数和报告

1．操作方法：培养到时间后，计数每 个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必 要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下 各平板的菌落总数后，求出同稀释度的 各平板平均菌落数，计算出原始样品中 每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。

2．到达规定培养时间，应立即计数。如 果不能立即计数，应将平板放置于0－ 4℃，但不得超过24h。
第四章 食品微生物检验的指标
一、菌落总数 二、大肠菌群MPN 三、致病性微生物 四、霉菌与酵母菌数
第一节 细菌相与食品卫生的关系



1、细菌相：指存在于某一物质中的细菌种类及其相对数量的构 成。 食品中的各种细菌就构成了该食品的细菌相，水中的细菌构成了 水的细菌相。细菌相是对细菌的种类面言，在菌相中相对数量较 大的一种或几种细菌被称为优势菌。 2、嗜冷菌：这类细菌在接近0℃时生长得比较好，最适温度为 10℃一20℃，最高温度在30℃一35℃。 3、嗜温菌：这类细菌都能在25℃气40℃迅速生长，在55℃不 生长。 4、嗜热菌：这类细菌生长范围为43℃～75℃，最适为50~C一 55~C，在32C以下很难生长。 嗜温菌和嗜热菌的一些细菌在生长温度范围上有重迭，产生芽胞 的细菌尤其如此。


2）食品中细菌数量可预测食品耐放程度和时 间 一般讲，细菌数越少，食品耐放时间越长；相 反，食品耐放时间就越短，例如用O℃保存牛 肉，菌落总数为103cfu／cm2时，可保存18天， 而当菌落总数增至lO5cfu／cm2时则只能保存7 天。另外，用0℃保存鱼时，菌落总数为105cfu ／cm2时可保存6天．而菌落总数在103cfu／ cm2时则可保存12天。
一、细菌相对食品卫生质量的影响

1、新鲜畜禽肉的细菌相：
主要是嗜温菌，包括大肠菌群、肠球菌、金黄色葡萄 球菌、魏氏梭菌和沙门氏菌等。 新鲜肉类的细菌相以嗜温菌为主，在温度适宜时，嗜 温菌会大量繁殖造成肉的变质，同时发生臭味；在冷 藏条件下，嗜温菌生长很慢甚至不生长，嗜冷菌开始 大量繁殖，逐渐成为优势菌，最后会导致肉表面形成 粘液并产生气味；在冷冻条件下，所有的细菌都不再 生长繁殖，因而可以较长期保存而不变质。