• 16.1.2植物原生质体的制备影响 • 16.1.3植物原生质体的纯化 • 16.1.4植物原生质体的培养方法
16.1.1植物原生质体的分离
•常用的分离方法 •机械分离法 •酶解分离法
★ 机械分离法
• －先将细胞放在高渗溶液中预处理，待细 胞发生轻微质壁分离，原体质体收缩成球 形式，再用机械法磨碎细胞，从伤口处可 以释放出完整的原生质体。
4）酶液的pH值：
• 取决于植物材料，一般在5.4-6.0；
• pH值低，酶活性强，分离快，但易于损害
细胞，原生质体产率低；
• pH值高，酶活性弱，分离慢，但不易损害 细胞，原生质体产率高；
植物材料的生理状态：
• 如株龄、发育状态、栽培条件等对取材影响很大；
• 一般选取体细胞分裂旺盛的材料； • 选取愈伤组织或胚状体效果更好。
纯化后的叶肉原生质体
植物原生质体融合
• 原生质体融合(protoplast fusion)：指通过 物理或化学方法，使遗传性状不同的两个 细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有 双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
• 还包括融合后的重组细胞分化再生形成新 物种的技术过程。
植物细胞杂交的几个重要进展
• 1960年，Cocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；
前言
• 植物原生质体的概念
• 植物原生质体融合的涵义 • 植物原生质体融合的发展
植物原生质体的概念
• 原生质体就是除去了细胞壁的裸露的球形 细胞。 • 原生质体具有一切活细胞的特性，同时具 有许多细胞完整细胞不具备的特点。这些 特点和植物细胞全能性结合起来，使植物 原生质体在遗传工程和体细胞遗传学中开 辟了一个理论和应用研究的崭新领域。
进行纯化。
2）离心沉降法
• 将上述滤出液置于离心管中，在70g100g下离心2-3分钟，原生质体将沉于管
底，细胞碎屑浮于上清液中。
• 弃上清，冲洗液冲洗，50g下离心3-5分 钟。
3）漂浮法
• 利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液做离 心液，将经过镍网初筛的过滤液置于蔗糖溶 液的顶部，在100g下离心10分钟，离心后， 碎屑沉淀，纯净的原生质体将出现在蔗糖溶 液和原生质体冲洗液的界面上。 • 利用移液管将原生质体吸出，转移到另一个 离心管中，用冲洗液冲洗3次。 • 离心质体数量和活力的因素
• • • • • • 1）材料特性与降解酶： 2）渗透压稳定剂： 3）质膜稳定剂： 4）酶液的pH值： 5）温度因子 25-27 ℃ 6）植物材料的生理状态：如株龄、发育状 态、栽培条件等对取材影响很大；
1）材料特性与降解酶：
• 不同种类植物或不同组织和细胞，其细胞 壁的组成和结构有差异； • 植物的细胞壁特性决定了分离原生质体所 用的降解酶种类与组合
• 1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。
原生质体材料来源
★ 植物叶片
－取材容易 －比较容易用酶解法分离
★ 植物根尖组织
－可由各种植物的种子萌发后取得
★ 植物花粉
－产生单倍体原生质体
★ 愈伤组织、悬浮培养的细胞
－细胞壁容易解离
16.1植物原生质体的制备
• 16.1.1植物原生质体的分离
刚游离出来的叶肉原生质体
16.1.3 植物原生质体的纯化
• 酶解后的混合物中将含有完整的原生质体、 亚细胞碎屑（叶绿体、维管成分）、未被消 化的细胞等，因而必须将这些杂质除去。
• 初步筛选：利用50-70µm孔径的镍丝网过滤 混合物，收集滤出液，做进一步的纯化。
1）过滤法
利用孔径更小的镍丝网过滤最初的滤出液
– －优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破 坏作用。 – －缺点：获得完整的原生质体的数量比较少。
★ 酶解分离法
– 常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶类（纤维 素酶、半纤维素酶、崩溃酶[Driselase]）、果 胶酶类（果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、 蜗牛酶和胼胝质酶。 – 优点：可以获得大量的原生质体，而且几乎 所有的植物或它们的器官组织或细胞均可用酶 解法获得原生质体。 – 缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过 氧化物酶以及酚类物质。影响所获原生质体的 活力。
第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion
• 学习目的：了解植物原生质体的制备和
融合技术，了解杂种细胞的筛选和鉴定
方法。 • 重点：植物原生质体的制备和融合技术 • 难点：植物杂种细胞筛选
内容
• • • • • • 前言 16.1植物原生质体制备 16.2植物原生质体融合 16.3植物杂种细胞筛选 16.4植物杂种细胞鉴定 16.5植物体细胞融合意义
2）渗透压稳定剂：
• 渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质
体免于膨胀破裂，而且还有助于酶和底物的结合， 原生质体从组织中加快释放。 • 常用的如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类 （KCl, MgSO4.7H2O)等；
3）质膜稳定剂：
• 增加对质膜的稳定性；促进原生质体细胞
壁再生以及细胞分裂。 • 如葡聚糖硫酸钾、氯化钙、磷酸二氢钾、 MES( 2-N-吗啉乙烷磺酸)等
• 1970年，Power首次用硝酸钠进行为诱导剂进行了较大规模的原生 质体诱导融合；
• 1971年，Nagata和Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生 完整植株； • 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是 第一个植物细胞杂种； • 1974年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相 应的融合技术； • 1978年，Melchers获得了第一个属间细胞杂种（番茄＋马铃薯）； • 1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；
原生质体的分离步骤
• • • • • • • （一）取材（叶肉细胞） 充分展开的嫩叶。 洗涤、消毒、无菌水冲洗。 对禾本科植物叶片消毒时，使用苄烷铵（Zephiran） （0.1%） - 酒精（10%）溶液漂洗5分钟效果最好。 （二）酶解 原生质体分离的情况在很大程度上取决于所用酶的性质和 浓度。 纤维素酶主要分解细胞壁纤维素。 果胶酶主要降解细胞壁间的中胶层。 有些组织在制备原生质体时，可能还会需要半纤维素酶。 离析酶是一种工程酶，可把植物组织分离成单细胞, 与纤 维素酶配合使用制备高等植物原生质体 。