叶片漂浮在酶液中。 或把叶片切成小块，结合真空处理效果更好。 或用金刚砂摩擦叶的下表皮。
3 提取方法
①机械分离法（Machanical isolation） ②酶法分离（Enzymatic isolation）
①机械法
早在1892年，克莱若克（Klercker）就已采用机 械法分离原生质体。 方法：细胞放入高渗糖溶液中，质壁分离，剪碎组织， 在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞 壁，从而释放出完整的原生质体。 缺点：产量低；方法繁琐费力；局限性大。分生组织 和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不能 用此法。
f cell colonies derived from protoplast,
g proto-calli developed from protoplasts embedded in agarose,
h green shoot formation,
i fertile green plant
Protoplast culture and fertile green plant regeneration of rye.
优点：可获得大量的原生质体，几乎适用 于所有植物的器官、组织和细胞。
缺点：酶制剂由于含有核酸酶、蛋白酶、 酚类等物质，影响原生质体的活力。
注意事项： ⑴酶溶剂及其渗透压 酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等 浓度范围450～800mmol/L
⑵酶处理： 酶浓度 酶解时间
界面法
①离心沉淀法
• 原理：原生质体的比重比较大，离心后原生质 体沉于底部。
• 步骤： 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心（500～1000rpm,离心5～6min）。 第三步吸去上清液，沉淀物重新悬浮，再离心 沉淀。如此2～3次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。
②漂浮法
原生质体分离常用的商品酶
酶
来源
生产厂家
纤维素酶类
onozuka R–10 绿色木霉
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
Cellulysin
绿色木霉
Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA
Driselase 果胶酶类
Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan
①材料准备：植物的幼嫩部分——幼叶、根、下 胚轴，亦可用成熟叶。禾本科用愈伤组织。
②材料预处理：
叶片萎焉处理——日光下2－8小时 叶片预培养——如羽衣甘蓝诱导愈伤组织 培养基 培养7天后 预先质壁分离——糖溶液中质壁分离
③ 酶解
• 纤维素酶类（Cellulase） • 果胶酶类（Pectolyase） • 半纤维素酶类（Hemicellulase） • 崩溃酶 • 蜗牛酶
a
b
c
d
e
f
a: first division, 10 days after protoplast isolation
b,c: 2 and 3 wo microcolonies.
d,e: 4 and 6 wo microcalli
f: 8 wo microcalli just before being transferred onto B5 medium
➢原理：利用比重大于原生质体的高渗蔗糖 溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣 碎屑沉到管底。
离心后碎屑沉到管底，一个纯净的原生 质体带出现在蔗糖溶液和原生质体悬浮液 培养基的界面上。
③界面法
原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其 中一种溶液密度大于原生质体的密度， 另一种溶液小于原生质体的密度。
100mmol/LCaCL2+300mmol/L山梨醇 +原生质体 140mmol/L蔗糖+360mmol/L山梨醇 500mmol/L蔗糖
Macerozyme R-10 根霉
Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan
Pectinase
黑曲霉 Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA
Pectolyase Y-23 黑曲霉
Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan
酶解温度
图示：原生质体分离过程（以叶片为例）
过滤、离心
加果胶酶 和纤维素酶
三、原生质体的纯化
材料在酶液中一段时间后，轻轻振动容器或挤 压叶片，使原来组织中的原生质体释放出来。
此时还有一些亚细胞碎屑，尤其是叶绿体、维管 成分、未被消化的细胞和碎裂的原生质体，因此必 须除去。
三种方法
离心沉淀法 漂浮法
由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到 细胞壁。
植株的年龄和生长条件是十分重要的。
来源： ① 无菌苗 ② 温室培养的苗
培养条件： 低光照强度（1000lx） 短日照 温度为20～25℃ 相对湿度为60%～80% 以及充足的氮肥供应。
2 前处理 要保证酶解能充分的进行，必须促使酶溶液渗
入到叶片细胞间隙中。为此，要做到： 撕去叶片的下表皮，以无表皮的一面向下，使
这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的 诺贝尔生理学与医学奖。
非对称细胞融合技术
所谓非对称细胞融合技术，即利用某种外界因素(常为 γ射线，即γ融合gamma-fusion)辐照某一细胞原生质 体，选择性地破坏其细胞核；并用碘乙酰胺碱性蕊香 红6G处理在细胞核中含有优良基因的第二种原生质体， 选择性地使其细胞质失活，然后融合来自这两个原性 质体品系的细胞，从而实现所需胞质和细胞核基因的 优化组合，或使前者被打碎的细胞核染色体片段中的 个别基因渗入到后者原生质体的染色体内，实现有限 基因的转移，从而在保留亲本之一全部优良性状的同 时，改良其某个不良性状。
②酶解法
1960年Norkinghan大学的植物生理学家 Cooking用酶法降解细胞壁，获番茄根尖原生 质体，开创了大量获得原生质体的的方法。
20世纪九十年代以来，国内外原生质体培 养取得了突飞猛进的发展。 1971年，Takebe 等人在烟草上首次由原生质体培养获得植株。 至今已获得酶法制备植物原生质体操作方法。
a Friable embryogenic calli, b suspension cell aggregates,
c freshly isolated protoplasts from suspension culture, d protoplasts stained with FDA, e division of cell derived from protoplasts,
曲酶Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA
Hemicellulase 黑曲霉 Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO 63178,USA
纤维素酶——从绿色木霉中提取。用于活力 不同：P1500、P5000、 OnozukaR-10 （常用）
果胶酶（离析酶）——从根霉、黑曲霉中提 取。浓度若超过2％，分离时间过长，均易产生 毒害。常用(MacerozymeR-10)。
半纤维素酶－从黑曲霉中提取。常用于从愈 伤组织中分离原生质体；常用Rhozyme HP-150；
蜗牛酶——分离孢粉素、胼胝质。
步骤： 二步法：离析酶→纤维素酶 一步法：复合酶处理
embryos. i: Transfer of cotyledonary stage embryos onto MS medium for conversion of embryo into plantlets.
四、原生质体培养研究进展
膜片钳技术
1976年[1]德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创 建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电 流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的 技术。它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱， 给生命科学研究带来了巨大的前进动力。
植物原生质体培养 （补充）
The cultivation of plant protoplast （Complementarity）
李宏富
一、两个概念
再生植株 工程植株
二、原生质体分离
1 材料来源 植物原生质体最方便的来源是叶片，因为叶片
中可以分离出大量的比较均一的细胞，而又不致使 植物遭到致命的破坏。
Recovery of plantlets through somatic embryogenesis
g
h
i
g: Transfer of microcalli onto B5 medium and induction of somatic embryos. h: Transfer of globular embryos onto B5 medium for maturation of somatic