第四讲 筛选新药之‘化合物’的重要源 泉 II 组合化学与组合生物合成
主要内容
一、组合化学简介 1 组合化学基本原理 2 固相组合化学合成 3 液相组合化学合成 二、定向生物合成 三、突变生物合成 四、抗生素基因工程简介 五、‘聚酮体途径’抗生素的生物合成 六、组合生物合成进展
组合化学概念
组合化学是一项新型化学技术，他利用一系列合成、
确认活性分子结构 编码技术已应用于解析组合库中高活性化合物的结构。最早提出此技 术的是Brenner和Lerner，Nicolaou等提出了射频编码合成仪突破了 以往的编码形式，它是建立在射频信号及应用多功能微反应仪的半导 体记忆装置基础上的。

组合化学策略

要合成大量的化合物，目前有两种不同的策略 可以进行：
液体相合成




由于液相合成存在一些不确定性，在合成的每一步之 后均需进行某种形式的纯化，如果用平行合成大量的 化合物，进行纯化的工作是相当烦琐的，如果用混合 物方式合成，那么，纯化过程几乎是不可能的。 因此人们将传统的液相合成的优点与固相合成的优点 结合起来，从而形成了液体相合成方法。 其原理是将化合物结合到一种可溶性高分子上，反应 后，经过调节反应体系的溶剂、离子强度、pH等使高 分子从溶液中沉淀下来。 目前使用的有聚乙烯醇单甲醚，它可以溶解在多种溶 剂中，但在乙醚中可以结晶析出。
不能用于需要长期溶剂化而达到连续流动合成的 目的。
因此人们又设计了许多新型大孔高聚物，其中
较好的是多孔玻璃，它是一种刚性的衍生化的玻 璃球状物，可以与任何溶剂相容，对腐蚀性溶剂 和高压、高温都比较稳定。
合成方法
茶叶包法
tea-bag
用具有74mm网眼的聚丙烯网袋
（15mmX20mm），里面装满树脂珠，密封好。 最初树脂珠上都连有一个保护的氨基酸， 然后它被浸在反应物核偶联剂的混合溶剂 中，把袋子集中进行脱保护、洗涤、中和 及再偶联等步骤。
定向生物合成

Directed Fermentation/Mutasynthesis. The changes in structure can be extended still further by feeding to the producing organism synthetic compounds, which are analogues of natural intermediates in the biosynthetic pathway (Directed Biosynthesis). This is particularly efficient if biosynthesis of the natural intermediate can be knocked out allowing all of the biosynthesis to be directed to the modified product (Mutasynthesis).
二、定向生物合成（Directed Biosynthesis)
生物合成工程

Biosynthetic engineering is the rational manipulation of the biosynthetic pathway for a microbial metabolite in order to generate novel products
树脂珠的种类

目前固相合成中较多使用的树脂是小的球状树 脂珠（80-200um）,常用的有以下几种
CH CH2 CH CH2 CH CH2
1 交联聚苯乙烯
CH CH2
CH2=CH
CH2=CH
CH=CH2
2 聚酰胺树脂
CON(CH3)2
CONHCH2CH2NHOC
3 多孔玻璃
聚苯乙烯和聚酰胺树脂通常缺乏结构上的刚性，
高通量筛选
High Throughput Screening
S1 S2 S7 S5 X S11 S8 S4 S9 S10 S13S6
S15 S14
S9 S S15 S14 10 S13 S6 S3S12 S1 S2 X S11 S7 S5 S8 S4
S3S12
S4
X
S11
S8
固相合成法


是最早以固相肽合成建立起来的组合方法。 固相合成Solid phase synthesis技术由Merrifield(1963)首创， 他使用取代的树脂作为固相载体来合成多肽； 但是大量的以多肽合成方法衍生出来的固相合成策略的应用是在 80年代才有了突破。
多针上的合成
在40mm, 苯乙烯针上合成。
在园片上合成
直径为4mm的聚
在直径0.635cm，厚度为 0.3715cm的聚苯乙烯上合成。
在薄片上合成
在玻璃片、纸片上合成
（50-400um）.
液相合成法 Solution phase Synthesis

由于应用固相合成的化学反应范围有 限，而且当反应物和产物连接到固相 载体上时，检测反应过程比较困难， 因此人们重新研究了液相合成方法。
混合均分法 Mix-Split
一珠一物法(one
bead,one compound)，
该方法依赖于在树脂珠上合成化合物，一定
数量的载体被分成相等的几部分，然后各部 分独自与不同的起始单体原料反应。
反应后，树脂的各部分又重新合并，混匀，
再被分成几部分，进一步与一系列试剂反应
图例
X Y Z
X Y
YX XX ZX XY YY ZY
Z
混合 均分 偶联
XZ
ZZ
YZ
X
YXX XYX XZX XXX YYX ZZX ZXX ZYX YZX XYY YXY XZY
Y
YYY XXY ZZY ZYY ZXY YZY
Z
XZZ YXZ XYZ
混合 均分 偶联
ZZ
D’
Feeding C’
E’
J
四、抗生素基因工程简介
抗生素药物基因工程实用化平台


从链霉菌中分离出8个聚酮化合物基因簇，其中聚醚类抗生素基因 簇为这一类别之世界首例。科研人员发现了聚酮链延伸过程中形 成聚醚的多个功能独特的基因，以及一个崭新的聚醚链释放因子。 国际上首例聚醚类抗生素—— —南昌霉素生物合成基因簇的结构 组成、聚醚链形成和释放的机制以及 整个抗生素生物合成组装的 分子模型，是我国迄今在抗生素分子生物学 领域最重要的贡献之 一。其基因簇已申请中国专利。这一课题的科研人 员还成功克隆 了国际上第一例烯类抗生素生物合成基因簇；同时利用已 经分离 的抗生素基因簇进行抗生素生产率提高和品种改造的遗传工程探 索，获得了提高霉素产量并产生了新结构化合物的菌株，为在抗 生素产 业上利用基因工程技术实现高产和开发创新药物提供了模 型平台。 上海交通大学与国家 基因组南方中心、华中农业大学、江西农业大学合作完成
五肽的合成



用20种天然氨基酸合成的五肽，组合起 来有以下种： 二聚体 202=400 三聚体 203=8000 四聚体 204=160,000 五聚体 205=3200,000
组合化学
1 组合化学是用于新药合成和筛选的一种全新的方法，1988年 Furda 等首先提出了此概念，而始于90年代初，它打破了逐一合 成、逐一纯化、逐一筛选的模式，以合成和筛选化合物库的形式 寻找和优化先导化合物，从而大大加快了发现药物先导化合物的 速度。 组合化学结合了化学合成、电脑设计、计算机技术等，能同时产 生许多种结构相关但有序变化的化合物，然后用高度灵敏的生物 学方法对这些化合物同时进行筛选，从中确定具有生物活性的物 质，再经结构测定，以期找到全新的先导化合物，具有其高效、 微量、高度自动化的特点。 分为三个阶段：分子多样性化合物库的合成；群集筛选（进行活 性检测）；活性分子的结构测定。化合物的合成包括化学合成和 生物合成两种；化合物库的筛选可以是固相筛选，也可以是液相 筛选或两者结合。
CH3CH2CH2COOH
CH3OH CH3CH2OH CH3CH2CH2OH CH3CH2CH2CH2OH
平行合成方式


是指在合成过程中以平行的方式同时合成多种 反应产物。 每个反应是独立进行的，如上述反应当每个反 应同时独立进行时，即为平行合成方式。
R1 R2 S R3 R4 SR1 SR2 SR3 SR4
2
3
组合化学基本原理

分子多样性化合物库的建立 如何设计模板分子；选择怎样的构建单元；确定何种合成方案；如何 完成自动合成等。

群集筛选 选定筛选模式为固相筛选或用何法（细胞功能筛选、受体筛选、抗体 筛选等）进行筛选，用何种指示剂（同位素标记、荧光标记、染料染 色)等。具体的筛选方法有三种：固相筛选、液相筛选和两者的结合 。
HPLC-MS analysis of an equimolar mixture of 16 heterocyclic compounds generated by a split and combine synthesis
固相合成的优点


1）可以使用过量的试剂使反应趋于完全。 2）反应结束后，可以通过过滤、洗涤固 相介质除去反应物。 3）节省了分离纯化的时间 4) 反应收率高，产物纯度高。
测试技术，在短时间内合成数目庞大的有机化合物，经 过高效生物活性筛选，从中发现一批具有活性的药物前 体。 组合化学是应生物学家建立起来的高通量筛选技术的 需要而产生的。 组合化学合成技术已经给传统的有机合成化学带来了 革命性的变化，是近年来科学上取得的重要成就之一。
组合化学的起源


组合化学最早起源于固相多肽合成。就本质而言， 组合化学是建立在高效平行的合成之上的，这种 合成方法步骤有限，但生成的化合物库内包含大 量化合物。 组合化学不是单一的一种技术，它包含了一系列 化学技术。它是一门交叉性学科，它以有机化学 为基础，与生物化学、药物化学密不可分，并涉 及到数学、物理和计算机等多门科学。而传统有 机合成方法是对单个分子分步合成，在数量上是 处于低层次的，合成速度太慢，无法满足对化合 物量的需要。