细胞生物学杂志Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＣｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００７．２９：６９２—６９６
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聚酮类抗生素组合生物合成
黄惠娟乔建军＋
（天津大学化工学院．天津３０Ｃ０７２）
摘要 组合生物合成是公认的产生大量“非天然”的天然产物的一种有效方法，也是近年
来药物创新与应用的研究热点和重要手段之一。目前，组合生物合成在聚酮类抗生素等生物活性
｝ＬＣ
其中：【１，３１ Ｒ＝Ｅ‘［２，４１ Ｒ＝Ｍｅ
围１ ＤＥＢＳｌ．ＴＥ与分别插入雷帕霉素模块２或５后的对照１６１
适用于生命科学各研究领域的宝尔超纯水系统，使实验数据更逼真Ｔｅｌ：０２１—６４０４０１６１
万方数据
ＷＷＷ ｂａｏｌｏｒ．ｃｏｍ
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别插入到全长的合成红霉素的ＰＫＳ中模块ｌ和模块 ２之间，结果得到了在相应位置多出一个结构单位的 十六元环的聚酮化合物。 ２．３ ＰＫＳ中模块的替换
由于聚酮化合物特殊的结构和合成机制、非凡 的多功能性和可塑性使得人们可以通过组合生物合成 方法便捷地获得由其他方式难于得到的新化合物Ⅲ。 因此，应用组合生物合成的方法直接地对聚酮化合物 生物合成途径中涉及到的一些酶的编码基因进行操 作（如模块／结构域的增加、减少、替换等），产生一 些非天然的基因组或者杂合基因而可能改变原有的 生物合成途径，从而可以间接地对聚酮化合物的生物 合成进行调控，以获得大量新的聚酮化合物或其衍生 物口一ｌ。本文对近年来聚酮类抗生素组合生物合成的 研究方法和思路进行了回顾与展望，对某些方法所存 在的问题与不足进行了讨论。
进行的大量试验中也有许多新的化合物产生Ｉｌ”。 ３．２模块中结构域的增加
ＭｃＤａｎｉｅｌ等１１２１将合成红霉素ＰＫｓ模块２的ＫＲ结 构域替换为来自于合成西罗莫司ＰＫＳ模块４的ＤＨ— ＫＲ结构域，与原模块的结构域相比相当于增加了一 个ＤＨ结构域，得到了一个含有Ｃ＝Ｃ双键的化合物。 类似地，Ｋａｏ等［１３１将合成红霉素ＰＫＳ模块２的ＫＲ结 构域替换为合成西罗莫司ＰＫＳ模块１的ＤＨ．ＥＲ－ＫＲ结 构域，得到了一个新的八元环化合物。由此可见，ＫＲ 结构域对底物的要求较宽容．可接受许多非天然底 物。由于不同来源的结构域没有非常严格的底物特异 性。因此可在不同的ＰＫＳ中发挥相应的酶催化活性。 ３．３模块中结构域的替换
在红霉素ＤＥＢＳ １的Ｎ端有一个称为荷载域 （１０ａｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，ＬＤ）的ＡＴ和ＡＣＰ域。ＬＤ是ＰＫＳ 基因簇的作用靶点，它以丙酰辅酶Ａ为起始单位通过 ＡＣＰ泛酰基转移至ＤＥＢＳＩ的ＫＳｌ半胱胺酰活化位 点。已知不同的ＬＤ对底物的选择性不同，利用ＬＤ 对底物的宽容性，用异源替换原ＬＤ可以改变所接受 的起始单元，从而获得新的聚酮化合物，如阿维菌素 的ＬＤ可以加载多达４０余种不同的化合物作前体［７１。 将阿维菌素的ＬＤ移接到红霉素ＤＥＢＳｌ的Ｎ端，改造 后的ＤＥＢＳｌ．ＴＥ在天蓝色链霉荫（ｓｆｒＰｐｆｏｍｙｃＰｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）中除产生了新的化合物外，还能接受阿维 菌素牛物合成的起始单位异丁酸或２一甲基丁酸而产 牛新的三酮体。Ｍａｒｓｄｅｎ等【ＢＪ用阿维菌素的ＬＤ替换 红霉素的ＬＤ，在构建的糖多孢红霉菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｉｌｙｓ． ｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）突变体中，产生了以阿维菌素生物合 成起始单位异丁酸和２．甲基丁酸为起始物的红霉素
聚酮化台物是由聚酮生物合酶（Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈａｓｅ，ＰＫＳ）催化合成的。据国内外新近研究 报道１１），目前所发现的ＰＫＳ可以归为三类：（１）Ｉ型ＰＫＳ 也称为模块式ＰＫＳ，它由若干个多功能多肽组成，每 一个多肽上都分别携带有独特的、非重复使用的催 化结构域，参与一轮聚酮生物合成反应的所有结构域 称为一个合酶单位，编码这个合酶单位的ＤＮＡ被称 为一个模块。如合成红霉素的ＰＫＳ由３个多肽域 （ＤＥＢＳｌ、ＤＥＢＳ２和ＤＥＢＳ３）６个模块组成：合成雷帕 霉素的ＰＫＳ由３个多肽域（ＲＡＰＳｌ、ＲＡＰＳ ２和ＲＡＰＳ ３）１４个模块组成。Ｉ型ＰＫＳ研究最为透彻，主要由 酮基合成酶（ｋｅｔｏ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＫＳ）、酰基转移酶 （ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＴ）、脱氢酶（ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，ＤＨ）、 烯酰还原酶（ｅｎｏｙｌ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＥＲ）、酮基还原酶 （ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＫＲ）和酰基载体蛋白（ａｃｙｌ．ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．ＡＣＰ）等结构域组成，其中Ｋｓ、ＡＴ、ＡＣＰ
物质的开发应用研究中已经取得了显著的成果。结合文献中的例子，回顾了运用组合生物合成在
天然产物的基础上产生更多结构及功能多样性的聚酮类抗生素的方法和思路，并对某些方法所存
在的问题与不足进行了讨论。
关键词
组合生物合成；聚酮化合物；天然产物
组合生物合成是在微生物次级代谢产物生物合 成基和酶学基础上形成的，通过对微生物代谢产物 合成途径中涉及到的一些酶的编码基因进行操作（如 替换、阻断、重组等）来改变生物合成途径产生新 的代谢旁路，利用天然产物生物台成机制获得大量新 的“非天然”天然产物的方法。
３ ＰＫＳ模块中结构域的组合生物合成
在不同的模块中减少、增加或者替换结构域是 组合生物合成形成新化合物的基因操作重点。 ３．１模块中结构域的减少
１９９１年，首次报道了对红霉素生物合成途径中 ＰＫＳ结构域进行改造的研究【３】，方法是将合成红霉素 ＰＫｓ模块５的ＫＲ结构域去掉使其功能失活，得到了 一个５位是酮基的新化合物。虽然形成的新化合物 不具有生物活性，但是实验的成功首次证明了可以通 过组合生物合成技术定向改造ＰＫＳ产生新的红霉素 前体６．脱氧红霉内酯Ｂ（６一ｄｅｏｘｙｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｄｅ Ｂ，６． ｄＥＢ）的类似物。此后又有文献报道可将ＴＥ结构域 直接连接到ＤＥＢＳｌ上。缩短后的ＰＫＳ基因依然能够 发挥作用。产生了不同于原有十四元大环内酯的三酮 内酯化合物［１０１。此外，在以红霉素ＰＫＳ为操作对象
碳链结构的一大类天然产物，可以分为两大类：复合 聚酮化合物和芳香族聚酮化合物。复合聚酮化合物 是低级脂肪酸在缩合反应后经过内酯化成环而产生 的一组分子，包括大环内酯类（如红霉素）、聚醚类 （如南昌霉素，ｎａｎｃｈａｎｇｍｙｃｉｎ）等抗生素。芳香族聚 酮化台物是低级脂肪酸在缩合反应后均保持非还原 状态，经过折叠和醇醛缩合形成六元环，芳香环随后 被脱水还原而产生的一组分子，包括葸环类（ｔｍ多柔 比星）、苯并异色满醌类（如放线紫红素，ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ） 等抗生素。
衍 生物，添加不同的前体则可合成ｃ一１３位为异丙基、
２一丁基等红霉素Ａ、Ｂ和Ｄ衍生物。由于有许多支 链羧酸可以成为阿维茼素的前体，冈此利用阿维菌素 ＬＤ广泛的底物特异性可以获得多种红霉素衍生物。 类似地，Ｐｆｃｉｆｅｒ等１９１用来源于合成利福霉素的ＬＤ替 换红霉素的ＬＤ也合成了在ｃ．１３位结合苯环的红霉 素衍生物。
不同ＰＫＳ模块选用小同的聚酮链延伸单位，不 同ＡＴ结构域识别不同的聚酮链延伸单位，相互替换 或者置换ＡＴ结构域可以导致新的聚酮化合物的产 生｛１４】。如用合成雷帕霉素ＰＫＳ模块２中具有丙二酰 专一性的ＡＴ ２结构域替换ＤＥＢＳｌ．ＴＥ模块１中具有 甲基丙二二酰专一性的ＡＴ １结构域，产生了两个在内 酯环的ｃ一４位都缺少一个甲基的新三酮内酯［１５Ｊ。Ｌｉｎ 等［ｔ６１第一次尝试在全长的ＰＫＳ中进行结构域的替 换。他们用合成雷帕霉素ＰＫＳ模块２中ＡＴ结构域 替换台成红霉素ＰＫＳ模块１中ＡＴ结构域，产生了在 Ｃ．２位缺少一个甲基侧链的新化合物。由于ＰＫＳ模 块中各个ＡＴ结构域对底物的结构和立体构型都有相 当严格的要求，因此，进一步地突变ＡＴ结构域可以 改变其底物特异性，拓宽创制新化合物的可能性。 此外。对底物特异性要求较宽松的ＫＲ结构域有时可 决定聚酬体上甲基或羟基手性中心的立体构型，因此， 可以用异源替换原合成红霉素ＰＫＳ模块中的ＫＲ结构 域，使得６．ｄＥＢ中的羟基构型（ｓ．型或者Ｒ．型）发生转 变，进而改变６－ｄＥＢ的立体结构。如用合成雷帕霉 素ＰＫＳ模块２中的ＫＲ ２结构域替换合成红霉素ＰＫＳ 模块６中的ＫＲ ５结构域，合成了３．位羟基差向异构 的６一ｄＥＢ衍生物“７１。
黄惠娟等：聚酮类抗生素组合生物合成
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是聚酮碳链延伸反应的“最小ＰＫＳ”；（２）ＩＩ型ＰＫＳ 也称为迭代式或芳香式ＰＫＳ，它是一个多酶复合体的 迭代体系（至少包含ＫＳ和ＡＣＰ），通过一套可重复使 用的结构域在重复的反应步骤中多次用来催化酚聚 酮结构的生成。ＩＩ型ＰＫＳ在起始单位和延长单位的 选择方面不及Ｉ型ＰＫＳ变化多样，它的结构多样性主 要来源于聚酮合成后的修饰步骤；（３）Ｉｌｉ型ＰＫＳ是可 重复使用的同源双亚基蛋白，属于查尔酮（ｃｈａｌｃｏｎｅ）合 成酶类。ＩＩＩ型ＰＫＳ与前两类ＰＫＳ截然不同，它不依 赖于作为酰基载体的ＡＣＰ及其上的４’一磷酸泛酰巯基 乙胺。也不像前两类ＰＫＳ是通过ＡＣＰ活化酰基辅酶 Ａ的底物．而是直接作用于酰基辅酶Ａ活化的简单羧 酸。尽管不同类型ＰＫＳ的结构和机制不尽相同，但 是所有类型的ＰＫＳ都有通过酰基辅酶Ａ脱羧缩合和 ＫＳ结构域或亚基来催化ｃ．ｃ键形成的功能。
聚酮化合物是由细菌、真菌、放线菌或植物
产生的一大类天然产物．是用于人类疾病治疗的重要 药物之一。因其重要的生物活性在临床应用中可以 作为抗生素（如红霉素，ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ Ａ）、抗癌药物 （如多柔比星，ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、低月Ｒ固醇剂（如洛伐他 汀，ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、抗寄生虫剂（如阿维菌素，ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎｓ）、 抗真菌剂（如两性霉素，ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ）、杀虫剂（如 多杀菌素，ｓｐｉｎｏｓｙｎ Ａ）以及免疫抑制剂（如雷帕霉素， ｒａｐａｍｙｃｉｎ）等。
随着分子遗传工程、ＤＮＡ测序以及生物信息 学等技术的发展与创新，人们对各类型ＰＫＳ的认知程 度逐步加深，对聚酮化合物生物合成机制有了更深入 的理解与掌握。应用组合生物合成方法对聚酮化合 物生物合成途径基因进行操作，可以获得更多新颖的
具 有生物活性的化合物。
２ ＰＫＳ中模块的组合生物合成
聚酮化台物中碳链骨架的构成单位与催化其形 成的ＰＫＳ模块之间有着一一对应的关系。因此，聚