国家结核病参比实验室推荐建议
基因芯片可以用于:
可疑耐药结核病患者查,它有望代替利福平和异烟肼的传统
药敏试验 可能使用层级: 地市和省级（医疗机构和疾病预防机构） 推荐理由:
1.在我国获得注册证书；
2.国内研究显示其敏感性和特异性和(TAT)较好； 3.民族品牌 4.数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；
[5 – 10] MGIT + 罗 0.92 (0.87-0.95) 氏
M, et al. JCM 2004; 42:2321-2325 2 Mean of 14 studies in MGIT960 = 10.7% (2.0-30.0) [ ] = acceptable range
1Cruciani
缺点：
仪器与试剂价格更昂贵。 未能解决高污染率的问题
液体培养
培养方法
罗氏培养
敏感性 (95% CI)
0.76 (0.73-0.79)
结果报告周期
涂阳 涂阴
污染 (%)
[3 – 5]
13.8-16.6
22.3
33.7
MGIT960
0.88 (0.84-0.91)
11.7
16.5
210.7(2.0-30.0)
YYY
显影
孵 育
洗涤
YYY
YYY
T-SPOT TB (ELISPOT)技术 抗原
IFN-
Y Y Y Y
单核细胞分离 TB抗原刺激，IFN- 释放
Y Y Y Y
一抗捕获IFN-
Y Y Y Y
与标记的二抗结合
Y Y Y Y
酶作用标记物－显色 每一斑点代表释放IFN-的 一个细胞
Y Y Y Y
Y Y Y Y
小结
用途 液体培养 LPA/基因 芯片 LED 更敏感、快速的培养 快速诊断M/XDR 涂阳病人发现 操作 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋ 生物安 全要求 ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ 费用 ＋＋ ＋＋ ＋
Xpert
快速诊断
＋
＋
＋＋＋
NTP中如何应用 － 给谁用？哪里做？怎么用？
国家结核病参比实验室推荐建议
液体培养用于:
• 不释放有毒气体 • 不需要暗室
• 操作人员工作负荷减轻
快速药敏-商业化线性探针检测（LPAs）
• GenoType ® MTBDRplus, HAIN – 检测结核分枝杆菌复合群以及利福平、异烟肼耐药相关的突变 – 检测XDR的试剂盒也已经发布 • INNO-Lipa Rif TB – 检测结核分枝杆菌复合群以及于利福平耐药相关的突变 – 大多数利福平耐药的菌株同时也耐异烟肼
• • • • 检测结核分枝杆菌 检测利福平耐药 直接标本检测 100分钟可获得结果
MTB / 利福平耐药性检测
工作流程
• • • • • • 痰 简单，仅需1个步骤的准备工作 获得结果的时间 < 90min 工作量: > 16 样本 / 天 / 模块 不需要生物安全规 综合控制 痰标本可以直接放 入模块中，而无需 与任何试剂进行混 合处理
原理：是BACTEC TB460的换代产品。标本经前处理后接种到系统配套的
液体培养基，该培养基中包被有对氧浓度敏感的荧光物质，当细菌生长 代谢消耗培养基中的氧时，氧浓度降低，荧光被激发，系统可以连续检 测荧光水平，自动报告结果。
优点：
系统进一步优化，操作更简便、自动化更强。 解决了BACTEC TB460的同位素污染问题。 24小时连续检测，有利于早期报告阳性结果。
T8C T8A
InhA WT2
-8
inhA 基因突变
MTBDRplus 反应条带(示范)
南非的经验：
• Genotype MTBDR plus assay:
– 直接从涂片阳性标本中检测rpob基因突变 (耐利福平), katG 基因 (高浓度异烟肼耐药), inhA 基因(低浓度异烟 肼耐药) • 灵敏度、特异度，阳性预测值、阴性预测值 – 耐利福平 98.9, 99.4, 97.9, 和99.7 – 耐异烟肼 94.2, 99.7, 99.1, 和 97.9 – 耐MDR-TB 98.8, 100, 100, 和 99.7
3.WHO 在全球推荐
国家结核病参比实验室推荐建议
LPA可以用于:
可疑耐药结核病患者查,它有望代替利福平和异烟肼的传统
药敏试验 可能使用层级: 地市和省级（医疗机构和疾病预防机构） 推荐理由:
1.在我国获得注册证书；
2.国内外研究显示其敏感性和特异性（TAT)较好； 3.WHO 在全球推荐 4.数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；
• • • •
WHO 鼓励使用的工具 可使用涂阳痰标本和培养物进行操作 快速、简便易用，仅需基本PCR技术 然而，价格比较昂贵，且不能检测造成耐药突变的热点区域外的 突变
11
MTBDRplus 操作流程
3) 杂交
1) DNA提取
用NALC/NaOH 处理痰标本
扩增产物和 固化在 膜上的特异性探针杂交
Barnard M, et al. Am J Respir Crit Care Med 2008;177:787-92
结核耐药检测基因芯片
基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰 样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。
通 量：两个一线抗结核药 速 度： 6 小时（比传统药敏试验法快 50-100 倍） 灵敏度：103 CFU/反应 特异性：对照设计严谨；自动判读
MGIT 7 ml + I MGIT 7 ml + R MGIT 7 ml + E
9,9 ml 蒸馏水
S
转移 0,5 ml 阳性 MGIT 培养物
转移 0,5 ml
GC
S
I
R
E
插入BACTEC MGIT 960
LED显微镜
• 发光二级管 (LED) 技术 – 提供价廉、稳定的光源 – 寿命 150,000 h – 反复开关不影响寿命
软件判读
结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书
样品制备仪
杂交仪
激光共焦扫描仪
获国家医疗器械证书和欧盟CE认证
International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 13:914-920, 2009（IF=2.3） 18
Xpert MTB/RIF
国家结核病参比实验室推荐建议
GenXpert 即将可以用于:
结核病可疑症状者检查, 可以作为结核病的辅助诊断方法
和结核病患者治疗效果判断, 它有望代替传统的培养和利福平 的药敏试验（可疑耐药结核病患者） 可能使用层级: 区县（？）、地市和省级（医疗机构和疾病预防机构） 推荐理由: 1.即将在我国获得注册证书； 2.国内外研究显示其敏感性和特异性，阳性结果报告时间优于传统 方法；
rpoB M UT2A (H526Y) rpoB M UT2B (H526D) rpoB MUT3 (S531L)
rpoB 野生型探针: WT1 - WT8
rpoB 突变探针: MUT1-3: D516V, H526Y, H526D, S531L
→ 野生型缺失 → 野生型突变
MTBDRplus katG
• • • • 肺外标本的有关证据尚有限 增加检测次数可能增加敏感性，但需考虑费用增加 适用于儿童 不能替代传统涂片、培养、药敏试验
QuantiFERON TB Gold™实验
步骤 1: 特异抗原激发淋巴细胞 步骤 2: 用ELISA 检测 IFN-
阴性对照
孵育 洗涤
YYY
IFN- 释放 ESAT-6 或 CFP-10
新诊断技术及其在NTP
中的应用
江苏省结核病参比实验室
NTP中现行实验室技术
• • • • 涂片：萋尼染色显微镜检 培养：固体培养基：简单法、离心法 药敏：固体培养基：绝对浓度法、比例法 菌种鉴定：鉴别培养基＋生化试验
传统实验室技术不能适应不断深入的结核病 防治工作的需要
实验室新诊断技术总览
• 细菌学检测方法 – 发光二极管荧光显微镜（LED） – 液体培养 • 分子生物学检测方法 – Genexpert – HAIN – Genechip • 免疫学检测方法 – ELISOPT&TSPOT 和Quantiferon – 血清学诊断方法
优点：
快速：将分离培养的阳性检出时间由常规培养所需的2-8周缩短 至3-14天，将药敏试验的报告时间由常规方法的4周缩短至1周。 操作简便、灵敏度高，可进一步做药敏试验、菌种初步鉴定。
缺点：
放射性同位素污染。 仪器与试剂价格昂贵。 未实现全自动化 污染率高
BACTEC MGIT 960 分枝杆菌生长指示管
2) PCR扩增 4) 结果判读
MTBDRplus rpoB
rpoB WT2
rpoB WT1
505 508 509 511
rpoB WT3
rpoB WT4
518
rpoB WT6
rpoB WT5
522
rpoB WT7
526
rpoB WT8
531 533
513 514 515 516
rpoB M UT1 (D516V)
性能
• 对 MTB特异 • 敏感性与培养相似 • 通过rpoB 基因检测利福平耐药
样本准备、扩增 、检测自动化
产品和系统设计
GeneXpert
• GeneXpert 系统的检测模块 • 测试模块的扩大和交换 • 对非分枝杆菌实验室人员仅需要最多1天的培训
Xpert MTB/RIF
浓缩细菌去除抑制剂
样本自动过滤和清洗
结束手工工作