TOPO 克隆技术 Gate－way克隆技术 TA 克隆技术，平末端克隆技术 预制克隆（基因库，基因组库） 测序技术
24 Invitrogen Proprietary & Confidential
5 基因导入
转化：以质粒为载体，将携带外源基因的载体 DNA导入原核细胞。 转染：将DNA，RNA，siRNA 或寡聚核苷酸导入到真核细胞中。 转导： 借助病毒将DNA转入细胞的过程。
6 Invitrogen Proprietary & Confidential
1.1.1.1 质粒的分类
克隆载体：应用于目标片断的复制和扩增
表达载体：强启动子，启动基因转录产生大量的mRNA，进行蛋白表达 具有表达必须的元件，及末端的短肽 依宿主细胞不同，分为真核表达质粒与原核表达质粒。 。
7 Invitrogen Proprietary & Confidential
Gene Viral System
Gene Yeast Gene Baculovirus
14 Invitrogen Proprietary & Confidential
Invitrogen 相关产品
反转录酶 一步RT－PCR 两步RT－PCR RACE 技术（5’ RACE, 3’ RACry) 全长cDNA克隆
分子生物学分析技术
Huang Xu Technical Support Aug, 2006
生物秀—专心做生物！ ｗｗｗ．ｂｂｉｏｏ．ｃｏｍ 易生物－领先的生物医药商务平台 ｗｗｗ．ｅｂｉｏｅ．ｃｏｍ 生物秀论坛－学术交流，资源共享，互助社区 ｗｗｗ．ｂｂｉｏｏ．ｃｏｍ／ｂｂｓ／
内容提要
1核酸 1.1 DNA 的主要类型 1.1.1 质粒（plasmid DNA） 1.1.2 基因组 （genomic DNA） 2 .1 RNA 的主要类型 2.1.1 mRNA 2,2,2 其他类型的RNA 2 中心法则 2.1 转录 2.1.1 转录 2.1.2 逆转录（反转录） 2.2 翻译（表达） 2.3 蛋白质 3 PCR （多聚酶链式反应） 4 克隆 5 表达 PCR酶，PCR试剂系统 TOPO克隆技术，Gate-way，限制性内切酶 预制克隆（基因库，基因组库） DNA 转化，DNA 转染， 五大表达系统 蛋白纯化，蛋白检测，功能分析 质粒DNA提取试剂 基因组DNA提取试剂 mRNA提取试剂 其他RNA提取试剂 核酸定量，标记试剂盒 qPCR 试剂盒 核酸检测试剂盒 核酸突变试剂盒
反转录酶（一步RT－PCR，两步R技术
2 Invitrogen Proprietary & Confidential
1 核酸分子的组成
核
酸
核酸就是由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸
核苷中的戊糖羟基被磷酸酯化，就形成核苷酸
核苷酸 磷酸
5 Invitrogen Proprietary & Confidential
1.1.1 plasmid DNA 的概念
质粒是存在于细菌等微生物细胞染色体以外，能独立进行复制和遗传， 可赋予宿主细胞一定生物学性状的共价闭环双链DNA分子。
1. 复制子：复制起始区，控制着质粒在细菌中的拷贝数 有ColE1,pMB1,pSC101 2. 选择标记基因：ampr, tetr, kanr、 3. 多克隆位点(multiple cloning site, MCS)： 4. 启动子(promoter)：启动基因的转录，如Ptac, PCMV, PSV40等。来自rRNA（核糖体RNA）
tRNA（转运RNA）
11 Invitrogen Proprietary & Confidential
Invitrogen 核酸产品
质粒DNA提取试剂（plasmid DNA） 基因组DNA 提取试剂 （genomic DNA） RNA提取试剂 （总RNA，mRNA，miRNA） 核酸定量试剂盒 （Quant－iT） 核酸标记试剂盒 （labelling Kit） 核酸检测试剂盒 （SYBR Green 系列） 核酸突变试剂盒 (GeneTailor) qPCR 试剂盒(实时定量试剂盒）
4.1 TOPO 克隆技术
22 Invitrogen Proprietary & Confidential
4.2 Gateway® 克隆技术
ccdB
at tL 1 at tR 1
gene
2 tL at
2 tR at
Entry Clone
+
Destination Vector
Kmr LR Reaction LR Clonase™ Mix
脱氧 核糖
核苷由戊糖和碱基缩合而成，并以糖苷键相连接， 糖环上的C1与嘧啶碱的N1或者嘌呤碱的N9连接。
核苷
戊糖 碱基
核糖
D-核糖（RNA） D-2-脱氧核糖（DNA）
3
A G T C U
腺嘌呤 鸟嘌呤 胸腺嘧啶 胞嘧啶 尿嘧啶
DNA：A，G，C，T RNA：A，G，C，U
Invitrogen Proprietary & Confidential
转化用感受态细胞 转染用阳离子试剂 培养基 腺病毒载体，慢病毒载体，杆状病毒载体 抗生素
30 Invitrogen Proprietary & Confidential
6 表达
基因表达就是基因转录及翻译的过程。在一定调节机制控制下，大多数 基因经历基因激活、转录及翻译等过程，产生具有特异生物学功能的蛋 白质分子
2.3 Protein (蛋白质）
蛋白质 是由一条或是多条肽链组成的大分子，每一条多肽链都是由一系列氨基 酸残基通 过肽键一个一个连接而成 多肽链的第一个残基保留它的氨基，而最后一个残基保留它的羧基，多肽链的末端分别被 称为N端和C端
组成氨基酸的特点 是具有H2N－CHR－COOH的普遍结构的两性分子
1.1.2 genomic DNA （基因组DNA）
基因组指细胞中所有DNA的总和，一般是指组成染色体的DNA。
10 Invitrogen Proprietary & Confidential
1 .2 RNA
总RNA rRNA，tRNA，mRNA 的总和
mRNA（信使RNA） 信使RNA，3’带有polyA，5’带有帽子结构
25 Invitrogen Proprietary & Confidential
转化方法（原核细胞）
电击方法 化学方法
Primary Use: CLONING
Plasmid Bacterium
Invitrogen Proprietary & Confidential
转染方法（真核细胞）
在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以 及带负电的细胞膜表面。形成DNA-阳离子脂质体复合物（图1）。一个约5kb的质粒会结 合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源 于内吞体和溶酶体。
31 Invitrogen Proprietary & Confidential
表达载体
强启动子 识别元件
32 Invitrogen Proprietary & Confidential
Gene Gene In Vitro Tags Gene Your Vector**
Gene E. coli
Gene Entry Clone
17 Invitrogen Proprietary & Confidential
3 PCR
The Power of PCR: Small DNA sample can amply to 2n (where n is number of cycles)
18 Invitrogen Proprietary & Confidential
27 Invitrogen Proprietary & Confidential
转导方法（病毒介导）
慢病毒表达系统
28 Invitrogen Proprietary & Confidential
杆状病毒表达系统
29 Invitrogen Proprietary & Confidential
Invitrogen 产品
gene
Apr BP Reaction BP Clonase™ Mix
ccdB
at tB 1
at tP 1
2 tP at
Expression Clone
2 tB at
+
Donor Vector
Apr
Kmr
23 Invitrogen Proprietary & Confidential
Invitrogen 产品
19 Invitrogen Proprietary & Confidential
Invitrogen 产品
PCR 聚合酶 PCR SuperMix PCR 产物纯化试剂盒 胶回收试剂盒 两步RT－PCR 反应
20 Invitrogen Proprietary & Confidential
4 克隆
13 Invitrogen Proprietary & Confidential
2.1 逆转录
RNA为模板, 在反转录酶催化下, 由dNTP聚合成DNA的作用, 信息流从RNA到DNA, 与DNA到RNA的方向相反, 故称为逆转录.
逆转录酶
mRNA
cDNA
RNA指导下的DNA合成作用，合成的DNA与mRNA序列互补，称为互补DNA（cDNA）
•
克隆，是英文“clone”一词的音译，是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有 完全相同基因组之后代的过程。 克隆一个基因是指从一个个体中获取一段基因（例如通过PCR的方法）然后将 其插入另外一个个体（通常是通过载体），再加以研究或利用。