生物化学复习提纲2015第一章蛋白质化学1．蛋白质、氨基酸的基本知识，名称、分类，重要的鉴定反应：氨基的反应，PITC，肽段顺序推导蛋白质的分类:简单蛋白:除氨基酸以外不含其他成分的蛋白质(清蛋白,球蛋白,谷蛋白,醇溶谷蛋白,组蛋白,精蛋白,硬蛋白)结合蛋白（conjugated protein）:除由氨基酸组成蛋白质部分外，还含有非蛋白成分，这些非蛋白成分，有时称辅基（prosthetic group）或配基(核蛋白,脂蛋白,糖蛋白,磷蛋白,卟啉蛋白,黄素蛋白,金属蛋白)根据蛋白质的分子外形分类⏹球状蛋白质（globular proteins）⏹纤维状蛋白质（fibrous proteins）根据蛋白质功能分类⏹结构蛋白质（structural proteins）⏹酶蛋白（enzymes）⏹运输蛋白质（transport proteins）⏹运动蛋白质（kinesis proteins）⏹贮藏蛋白质（storage proteins）⏹防御蛋白质（defensive proteins）蛋白质的水解:酸水解:优点是不容易引起水解产物的消旋化。
缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；天冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。
碱水解:由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。
部分的水解产物发生消旋化。
该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。
酶水解:应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。
水解的产物为较小的肽段。
2．氨基酸、多肽的等电点计算、光吸收性质、甲醛滴定的原理氨基酸等电点:中性:对于侧链基团不解离的氨基酸有：pI = (pK1+pK2)/2酸性:pI=(pK1+pKR)/2碱性:pI=(pK R+pK2)/2多肽等电点:酸性:pI=1/2（pK’R+ pK’ -COOH）碱性:pI= pK’R+lg（等电点侧链解离数/未解离数）甲醛滴定的原理:向AA溶液中加入过量的甲醛，用标准NaOH滴定时，由于甲醛与Aa中的-NH2作用形成-NH.CH2OH -N (CH2OH)2等羟甲基衍生物而降低了氨基的碱性，相对地增强了-NH3+的酸性解离，使Pk'2减少了2-3个pH单位，NaOH滴定的曲线A向pH低的方向转移，滴定终点也移动pH9附近。
光吸收性质蛋白质在280nm处有强烈的光吸收⏹Phe、Tyr、Trp⏹Trp贡献最大3．肽键的特点，肽平面肽键的特点:(1)酰胺键：由于酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基的共振作用，表现出高稳定性1.C－N具40％双键性质2.C＝O具40％单键性质3.共振杂化体(2)亚氨基（－NH－）pH 0－14没有明显的解离和质子化倾向肽键是一个平面，称肽平面。
可以有反式顺式结构，但旋转能障高，反式稳定（Pro 例外）(3)蛋白质中的每一个氨基酸单位称氨基酸残基（residue）1．蛋白质一级结构的概念，分析方法，N-，C-末端、Edmen降解，二硫键定位等蛋白质的一级结构:蛋白质的共价结构，即蛋白质分子内部通过共价键连接而形成的结构形式分析方法，N-，C-末端:N端:(1)二硝基氟苯（DNFB or FDNB法），Sange试剂(2)丹磺酰氯（DNS）法原理：与DNFB相同优点：DNS具强烈的荧光，检测灵敏度可以达到1⨯10-9mol比DNFB法高100倍(3)苯异硫氰酸酯（PITC）法：逐个脱去。
此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。
(4)氨肽酶法：氨肽酶：可以从多肽链的N端逐个降解氨基酸的肽链外切酶亮氨酸氨肽酶（LAP）：水解以Leu为N末端的肽键速度为最大C端:肼解法,还原法.羧肽酶法二硫键定位:(1)胃蛋白酶水解(2)过甲酸打开二硫键(3)双向电泳法分析2．常见蛋白酶的水解位点，水解方式：胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶作用特点，内切酶，外切酶3．蛋白质二级结构：定义，α-螺旋、β-折叠的结构要点，二面角蛋白质的二级结构:是指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠。
它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键α-螺旋:(1)肽链内每个残基Cα的成对二面角φ和ψ各自取同一数值：φ＝－57°ψ＝－48°(2)右手、左手螺旋。
均由L-型Aa残基构成，右手α-螺旋和左手α-螺旋不是对映体，蛋白质中α-螺旋几乎均为右手的，右手的比左手的稳定(3)每圈螺旋占3.6个AA残基，沿螺旋轴方向上升0.54nm。
肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-C=O基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。
(4) α-螺旋是不对称的分子结构，具有旋光能力，天然α-helix的不对称因素引起右旋。
α-螺旋结构中重复性结构命名：第一个数字表示每圈螺旋包含的残基数，下标数字表示氢键封闭的环所包含的主链原子数，同时也可标出氢键封闭的环内的重复单位数常见的螺旋形式螺旋(n=3)：非整数螺旋，蛋白质中α-螺旋结构的主要类型。
①3.613②3螺旋（n=2）：一般只出现在β-转角内10螺旋（n=4）: 紧缩螺旋，某些核酸结合蛋白③4.416β-折叠:(1)两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，相邻肽链上的－NH和C ＝O之间形成有规则的氢键，这样的多肽构象就是β－折叠。
(2)平行式：各肽链的排列极性（N→C）是同一方向的，Φ＝－119°ψ＝+113°，重复周期0.65nm，常见于球状蛋白(3)反平行式：相邻肽链的极性相反，Φ＝－139°ψ＝+135°重复周期0.70nm，常见于纤维状蛋白(4)所有的肽键都参与链间氢键的交联，氢键与肽链的长轴接近垂直。
多肽主链为据齿状折叠构象，侧链的Cα－Cβ键几乎垂直于折叠片平面，侧链R 基交替地分布在片层平面的两侧二面角:Φ角--绕C-N1键旋转的角度,Ψ角--绕Cα-C2键旋转的角度 ,每一对αΦ、Ψ 称肽平面的二面角.4．蛋白质三级结构：定义，稳定因素、超二级结构，结构域，胶原蛋白结构蛋白质的三级结构:是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构蛋白质表现完整生物活性的最低构象要求，即只有具有了完整的三级结构，才能表现出蛋白质的生物活性稳定因素:氢键、疏水键、离子键和范德华力等。
疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用超二级结构:在蛋白质中，特别是球状蛋白质中，若干相邻的二级结构单元组合在一起。
彼此相互作用，形成有规则，在空间上能辨认的二级结构组合体充当三级结构的构体，称为超二级结构。
在结构的组织层次上高于二级结构，但没有构成完整的结构域① αα型② βαβ型③ βββ型胶原蛋白结构:胶原蛋白在体内以胶原纤维的形式存在。
其基本组成单位是原胶原蛋白分子胶原蛋白的二级结构是由三条肽链组成的三股螺旋，这是一种右手超螺旋结构。
螺距为8.6nm，每圈每股包含30个残基。
其中每一股螺旋又是一种特殊的左手螺旋，螺距为0.95nm，每一螺圈含3.3个残基,每一残基沿轴向的距离为0.29nm5．蛋白质四级结构：定义，稳定因素、别构效应, 红细胞携氧机制，意义蛋白质的四级结构:是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白稳定因素:亚基间的疏水作用别构效应:指蛋白质与配基结合改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质的生物活性的现象别构蛋白质（allosteric protein）：具有别构效应的蛋白质，多为寡聚蛋白，包括活性部位和调节部位红细胞携氧机制，意义:血红蛋白的结构与功能①组成：4个亚基组成，成年人红细胞由α、β两种亚基各两条构成每条肽链都卷曲成球状，都有一个空隙容纳一个血红素，它们都能与氧气结合。
以α2β2四聚体形式存在一分子Hb能与4分子氧气结合②分析Hb与氧气结合，发现Hb的4个亚基和4个氧气结合时平衡常数（Keq）并不相同。
而是有4个不同的平衡常数，Hb与最后一个氧气结合时其结合力最大Hb与氧气结合将影响其四级结构，即亚基与亚基之间的相对位置发生变动，这种变化增强了Hb和O2的亲和力6．蛋白质的化学性质，光吸收、颜色反应、双缩脲反应，变性、复性蛋白质的化学性质:胶体性质,酸碱性质蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关颜色反应:① 双缩脲反应：与CuSO4碱性溶液反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物，540nm 处有最大光吸收② 米伦反应,乙醛酸反应,坂口反应,酚试剂光吸收: 蛋白质在280nm处有强烈的光吸收Phe、Tyr、Trp,Trp贡献最大变性沉淀因素：⏹高温⏹强酸碱⏹重金属盐⏹有机试剂：溶剂、脲、胍、生物碱⏹去垢剂：SDS（十二烷基磺酸钠）7．蛋白质的分离纯化和鉴定：一般过程、常用方法，差速离心（单位）、密度梯度离心、SDS-PAGE，层析分离原理，分子排阻层析、亲和层析，蛋白质组学。
蛋白质分离提纯的得率、纯化倍数等的计算一般过程:(1)前处理(分离组织--破碎细胞---去其他组分)常用方法(①超声粉碎,②微研磨,③酶消化④超速离心)注意问题：保持蛋白质的完整和活性(2)粗分级常用方法：盐析法、等电沉淀、有机溶剂(3)细分级(进一步提纯)常用方法：层析、电泳(4)结晶蛋白质分离纯化常用技术:1,沉降分离:蛋白质分子量、形状的不同会产生密度和沉降速度的差异①差速离心（单位）:利用蛋白质分子在离心力场的作用下沉降速度的差异分离不同蛋白质单位离心力场下，物质的沉降速度与分子量和分子形状有关,在生物化学中常用沉降系数表征分子量沉降系数定义：单位离心力场下的沉降速度（1-vp）为浮力因子f：摩擦系数Svedberg单位：10-13秒，S②密度梯度离心:利用物质在密度与其相同的溶液中不会沉降的特点区分不同密度的物质2,层析、色谱① 分配层析:一般原理：利用待分离物质在流动相和固定相中分配系数的不同，使物质间出现移动速度的差异，从而区分不同的物质常用方式：分配柱层析, 滤纸层析. 薄层层析, 离子交换层析, 气相色谱离子交换层析原理：利用不同离子在不同的pH下与固定相结合强度的差异，使待分离的物质在特定条件下与固定相中的同型离子发生交换，而与固定相结合，从而区分不同物质洗脱方式::①分段洗脱②梯度洗脱分子排阻层析:原理：利用具有不同孔径的多孔网状结构的凝胶珠作为分离介质，小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。
又称凝胶过滤、分子筛亲和层析:原理：利用待分离蛋白质与固定相中相应配体的特异性结合，将目标蛋白质与其他物质分开一般步骤⏹制备交联有配体的层析柱⏹蛋白质上样，平衡⏹杂质洗脱⏹可溶性配体洗脱目标蛋白质3.电泳⏹①SDS-PAGE:用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，可以将凝胶分别作成浓缩胶和分离胶两部分.⏹浓缩胶一般孔径较大，pH6.8，分离胶一般孔径较小，pH8.8⏹样本加入SDS（十二烷基磺酸钠）、巯基乙醇、尿素处理，使蛋白质分子带上均匀的负电荷，分子形状变为一致的杆状分子，消除电荷差异和分子形态差异的影响。