生物医学工程学杂志　1999∶16(1)∶86～90 J Biomed Eng细胞培养法评价生物材料生物相容性研究进展梁卫东1　综述　石应康　审校(华西医科大学附属第一医院胸外科,成都　610041) 内容摘要　细胞培养法检测材料生物相容性是一种快速、简便、重复性好又价廉的方法,在材料生物相容性评价中起着越来越重要的作用。

由于新材料不断涌现、材料植入体内的部位及使用目的日趋繁杂、材料毒性作用的强弱以及材料与机体反应的复杂性等因素决定了细胞毒性试验中实验方法及实验细胞的多样性。

根据生物材料本身的理化特性、植入体内的部位及使用目的选择适当的实验方法和实验细胞至关重要。

以往对材料生物相容性的评价往往着眼于细胞的形态与数量的变化,近几年来研究材料对细胞生长、附着、增殖及代谢方面影响的报道日趋增多,并提出了以有活力的细胞数和细胞生长作为材料生物相容性评价标准的观点。

通过结合免疫、化学、放射及影像学等多学科的技术发展,使人们进一步深入了解细胞结构和功能的变化关系,进而阐明材料对细胞的作用机制,是今后细胞培养法评价材料生物相容性的发展方向。

关键词　生物材料　细胞培养　相容性　毒性实验The Research of Evaluation the Compatibility of BioticMaterial in Cell-cultureing MethodLiang W eidong　Shi Yingkang(Department of Thoracocard iac Surgery,The First University Hospital,WestCh ina University of Med ical Science,Cheng du　610041) Abstract　It is quick co nv ienent g o od-r epea ting and cheap tha t ex amining th e bio tic ma teria l's co m-pa tibility thro ug h cell-culturing me tho d,a nd it is mo re and mor e impo r ta nt in ev alua ting the co mpa tibil-ity of bio tic material.The new ma teria l appea ring co ntinously complica ting o f th e par t and aim ma teria l be planted in the intensity of mate rial's toxic effec t the r eactio n's complica tio n o f ma terial and bio tic body,all o f these decide the va riety of ex periment method a nd cells in cell to xicity ex periment.It is ve ry impo r tant that choices the righ t ex periment method and cells a cco rding to the ma terial's charac ter the pa rt and aim the ma terial be pla nted in.The eva luatio n o f biotic ma teria l's co mpa tibility stressed o n the changing o f cell's fo rm a nd qua ntity befo r e.In recent y ears,mo re a nd mo r e repo rts a ppear about mate rial influences the g r ow th.adhesio n pro liferation and metabolizing o f cell,a nd pr esents the point that the eva luation standar d o f bio tic mate rial's co mpa tibility sho uld be set acco rding to the activ e cell's quantity a nd their g r ow bining many subject's technological dev elo pment,such a s immuno lo gy, ch emistr y,radia tio n and shado wg raphy,th or oughly inquires the changing relatio n o f cell's structure and funtio n,further ly clarifes the material's effect on cell.It is th e dev eloping dir ec tion in the future that e-v aluates the bio tic material's co mpa tibility in cell-culturing m eth od.Key words　B io tic mate rial Cell-culturing Compatibility T oxicity ex pe riment1现在攀钢职工总医院胸外科,攀枝花　617023 生物材料的临床应用已有较长的历史,广泛应用于牙科、眼科、整形外科及心血管外科等领域。

目前美国每年有2～3百万人工脏器或假肢植入人体中。

生物材料不仅要具有临床使用时所需要的理化性能,还必须具有良好的生物相容性,以保证使用安全。

如何快速准确地评价材料的生物相容性,对于研制新材料和缩短研制周期起着重要的作用[1]。

根据1982年美国国家标准学会和牙科协会(AN SI/ADA)公布的评价生物相容性实验标准草案,评价生物相容性的实验方法有短期全身毒性试验(口服法)、急性全身毒性试验(静脉注射法)、吸入毒性试验、溶血试验、致癌试验、显性致死试验、细胞毒性试验、皮下植入试验、骨内植入试验、过敏试验等[2]。

细胞培养法作为检测材料毒性的手段(亦称细胞毒性试验),具有简便、敏感性高、节省动物、节约经费、缩短生物材料研究周期等优点,正日益受到人们的广泛重视。

本文就该研究领域近几年的发展及动向作一简介。

1　细胞毒性试验方法的进展1948年Rosen Bluth等首次报道利用鼠成纤维细胞培养来筛选聚合物,开始了细胞毒性试验评价生物材料的生物相容性的研究与应用工作,迄今为止在这方面已有大量的工作积累与研究发现。

细胞毒性试验在评价材料生物相容性的地位已得到公认[3]。

由于目前对生物相容性概念及机理还完全了解,加之材料的多样性、置入机体内环境中的变异性、材料与机体作用的复杂性等因素,故迄今为止,国内外还没有一个统一的细胞毒性试验方法。

细胞毒性试验由于细胞培养方式(如单层细胞培养、细胞悬液与材料混合培养、细胞在材料上培养等)的不同,细胞与材料之间有无间质(即细胞直接与材料或其浸出液接触,还是通过间质接触)以及材料毒性成份(即材料本身、浸出物、扩散物或材料降解产物等)不同决定了细胞毒性试验方法的多样性。

根据细胞和材料之间有无间质可以将细胞毒性试验方法分为间接法与直接法两大类。

1.1　间接法最典型的间接法是琼脂覆盖法,该法是Dubecco在1952年首先提出[4]。

其方法是将含有培养液的琼脂层平铺在有单层细胞的培养皿中,再在固化的琼脂层上放上试样进行细胞培养。

此法优点是不管试验材料是什么形态(膜、粉末或油脂状)等都适用。

但该法敏感性受试样溶出物在琼脂层上扩散程度的影响。

当溶出物分子量小,易溶于水,其毒性发现早且较强。

反之即使有毒的材料,如溶出物分子量大并难溶于水,使用该法时材料毒性就难以表现出来。

为克服琼脂法的缺点,Sabita Sriva等提出分子滤过法[3]。

该法是在单层细胞上覆盖一层丙烯盐制成的微孔滤膜,将试样材料放在滤膜上,使材料毒性成份通过滤膜作用于其下的细胞。

由于滤膜微孔直径约0.45μm,Bo ndem ark 认为该法适合评价毒性成份分子量小的材料的生物相容性[5]。

Van Luyn等1992年报道用甲基纤维素细胞培养法评价聚合物的细胞毒性[6]。

该法是在甲基纤维素中混入细胞和培养液,再将材料放在固化的甲基纤维素表面进行培养。

该法优点是生物材料的水解及细胞坏死释放出的蛋白分解酶引起的酶解作用均可发生,因此可同时观察到生物材料的原发性及继发性细胞毒性。

1.2　直接法生物材料中一些易溶出物质是引起炎症反应和组织反应的主要原因。

易溶出物质一般是原料单体、低分子聚合物、催化剂、溶剂、稳定剂、乳化剂等。

为研究这些溶出物的细胞毒性,一些学者提出浸出液法。

该法是将试样投入培养液或蒸馏水中在适当条件下进行浸泡,制备出含有溶出的浸泡液再将浸出液加在含有细胞的培养皿或试管中继续培养,观察溶出物对细胞的影响。

Oshima认为不同浸提条件和浸提方87第1期 梁卫东等。

　细胞培养法评价生物材料生物相容性研究进展式所制备的材料溶出物在细胞敏感程度上并无显著性差异[7]。

直接浸渍法:该法是该形态不规则的试样(如金属粉末、油脂类材料)等与细胞一起放入培养皿中进行培养。

当有溶出物时试样周围的细胞就会受到影响。

宋淑华等1988年用该法对医用硅胶及聚乙烯醇进行细胞毒性试验[8]。

作者认为对于形态不规则有微量毒性的材料使用该法较为适宜。

另一些学者在直接浸法基础上提出直接接触法。

该法将细胞直接放在生物材料上进行细胞培养。

当有毒性物质释放时,由细胞形态变化和数量增减检测细胞毒性程度,同时可以直接观察到细胞在材料表面贴附情况。

直接接触法不仅能直接检测材料溶出物的细胞毒性,同时也是考察材料与组织细胞相容性的重要手段。

通常“材料生物相容性好”,很多场合都是指细胞容易贴壁且能迅速繁殖生长。

因此可根据直接接触法细胞培养的结果推测材料植入人体后与机体细胞的反应。

但是,对于与血液接触的循环系统来说,为了避免引起血栓形成,就希望细胞难以贴壁且不易增殖。

因此应根据材料的使用目的,作出相应的生物相容性判断。

Tsuchiya[9]等于1994年对琼脂法、分子滤过法、浸出液和直接接触法对材料的细胞毒性敏感程度的差异性进行比较。