3 . 引入辅助因子法
酶活性中心 金属离子 将金属离子引入抗体酶，催化肽键的选 择性水解
三乙撑胺Co3+盐作为金属离子辅因子，所用半 抗原分子带有一肽键。且通过羧根及仲胺基与金 属离子相连。将此半抗原通过共价键连接在载体 蛋白免疫动物产生的抗体，在金属离子复合物作 为辅因子的参与下，这些抗体酶能选择性水解甘 氨酸和丙氨酸之间的肽键 .
第二节、生物技术诊断制剂



重组表达抗原(Recombinant antigen) 核酸图谱分析(Atlas of Nucleic Acid) 核酸探针(Nucleic acid probe) 聚合酶链反应(PCR) 基因芯片(Gene chip)
一、重组表达抗原

基因工程重组表达抗原是用DNA重组技术，将编码特定抗 原的基因插入原核或真核表达质粒，再转入宿主中使其高效表达， 然后运用生物化学分离、纯化技术，提取表达产物等，最终制成 诊断用重组表达抗原。
– 噬菌体表面展示技术（phage display technology）
全套抗体（the immunoglobulin repertoire）基因库

将全套抗体基因库中的VH基因与有限数 目的VL基因排列组合构建Ig，从中可筛 选出有催化作用的抗体。
– Ig与抗原结合的作用主要来自重链
三 、催化抗体(catalytic antibody)
嵌合抗体（chimeric antibody）

嵌合抗体是指在同一抗体分子种含有不同种 属来源抗体片段的抗体，又称杂种抗体。
– “鼠－人”型
重构抗体（reshaping antibody）

在嵌合抗体的基础上，进一步将鼠Ab超变区基 因嵌入人抗体Fab骨架区的编码基因中，再将 此DNA片段与人Ig恒定区基因相连，然后转染 杂交瘤细胞，使之表达嵌合的V区抗体。
（四）单克隆抗体的应用
1.血清学技术：可取代原有的多克隆抗体，用于 传染病的诊断及病原的分型，避免了多克隆抗体 引起的交叉反应。提高检测生物活性物质水平 2.免疫学基础研究：促进抗体结构的进一步探讨， 淋巴细胞CD及细胞组织相容性抗原的分析 3.肿瘤治疗：肿瘤特异性抗原的单抗，与药物或 毒素连接制成免疫毒素，又称生物导弹 4.抗原纯化：亲和层析柱，提取抗原；基因工程 疫苗筛选保护性抗原成分或决定簇
高特异 、高纯度 、均质性好、 重复性强 成本低并可大量生产 常规方法无法制备的抗原 优 点 高危险病原
二、核酸图谱分析
核酸电泳图谱 核酸酶切图谱 寡核苷酸指纹图谱

（一）核酸电泳图谱分析

1、质粒图谱分析
质粒相对稳定性
细菌分型、流行病学调查
简便、特异、快速、可靠 缺点：
一些细菌无质粒或质粒不稳定 质粒相对分子质量相同而核苷酸序列不 同的菌株无分辨能力
– 抗体酶切割蛋白质和核酸 – 水解病毒蛋白质的抗体酶 – 肿瘤治疗 （ADEPT技术）

3、戒毒方面的应用
• 阻断可卡因、鸦片和受体的结合
1、B细胞的制备：提纯的抗原免疫Balb/c或其它品系的纯系小鼠，取 小鼠脾脏，制备B细胞
2、骨髓瘤细胞的制备：相同来源小鼠的骨髓瘤细胞，营养缺陷，不能 在HAT培养基上生长
3、饲养细胞的制备：小鼠胸腺细胞、腹腔巨噬细胞等
4、HAT培养基筛选杂交瘤的原理
小鼠
脾细胞
PEG
小鼠
H: 次黄嘌呤 A：氨基喋呤 T：胸腺嘧啶核苷
（Oligonucleotide fingerprinting ）。
抗原变异分析
疫苗株与野毒株的鉴别
分析同源性和变异性，有助于研 究病毒的变异趋势，跟踪毒株的 来源，扩散途径及目前的优势流 行株，有助于爆发流行的预测
三、核酸探针
用放射性同位素、地高辛或生物素等标记核酸分子或其它一条链作为核 酸探针，与处理样本中存在的互补链结合为双链，该反应称核酸杂交或 分子杂交。 Southern blot ——DNA Northern blot —— RNA

也称抗体酶(abzyme),是具有催化活性的 免疫球蛋白，具有抗体的高度选择性和 酶的高效催化性。
抗体酶的特点
1、与天然酶相比抗体酶的特点 能催化一些天然酶不能催化的反应 有更强的专一性和稳定性 催化作用机制不同 2、抗体酶和非催化性抗体作用的比较 更高的反应特异性 反应的可逆性 反应的量效性 反应过程
RFLP（限制性酶切片段 长度多态性） 细菌基因特征的重要指标
与核酸杂交技术联合使用 更有利于判断和解释
（三）寡核苷酸指纹图谱分析
将纯化的RNA经一种特殊的RNA酶（通常为T1酶）消化后，产生许 多理化特性和大小不同的寡核苷酸片段，经PAGE双向电泳分离后 进行放射自显影，形成类似指纹的图谱，即寡核苷酸指纹图谱
二、基因工程抗体

用基因工程技术制备抗体分子，这种抗体分子 称为基因工程抗体（genetic engineering antibody）。
– – – – – – 嵌合抗体（chimeric antibody） 重构抗体（reshaping antibody） 单链抗体（single-chain antibody） Ig相关分子 噬菌体抗体（phage antibody） 全套抗体（the immunoglobulin repertoire）基因库
稳定性
标准化 交叉反应 沉淀反应
较好
较难，不同批次的抗体质量差异 较大 很常见，难避免非特异反应 有
相对较差，对理化条件敏感
易于标准化，批次间差异较小 不常见，可避免非特异反应 大多数没有
杂交瘤技术制备单抗
将经预定抗原免疫的淋巴细胞与失去次黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶（HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）合成能力的骨髓瘤细胞系 融合，产生杂交瘤细胞，经过培养，筛选或克隆化，获得既能分泌针 对预定抗原的单抗又有无限繁殖能力的杂交瘤细胞系，这就是淋巴细 胞杂技瘤技术（lymphocyte hybridoma technology）。
骨髓瘤细胞
A
B
未融合的A 相互融合的A
A与B融合
相互融合的B 未融合的B
HAT选择培养液中培养
HGPRT+
TK+
HGPRT+ TK+
代谢完整并能 连续培养
HGPRT－ 或 细胞存活 并增殖
细胞死亡
5、细胞融合：脾细胞与骨髓瘤细胞按一定比例混合，离心后吸尽上清液， 然后缓慢加入融合剂－50％PEG。静置90S，逐渐加入HAT培养基，分于 加有饲养细胞的96孔细胞培养板孔中，置5％－10％CO2培养箱。
在人抗体可变区序列内嵌入鼠源抗体的高变区 基因序列，通过这种置换为人类抗体提供了一 个新的抗原结合部位。
单链抗体（single-chain antibody）
单链抗体(ScFv)是由VH和VL通过连接肽（接头）重组并表达而成 的另外一种小分子抗体。 具有较好的抗原结合能力，且分子量小、穿透力强、体内循环半衰 期短及免疫原性低等特性。 在此基础上，可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子， 是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件 。
6、杂交瘤细胞的筛选：血清学方法检测各孔抗体 筛选阳性抗体
7、杂交瘤细胞的克隆化：尽早克隆化，反复克隆3-5次使杂交瘤细胞稳定 有限稀释法
显微操作法
软琼脂平板法：45℃
8、杂交瘤细胞的冻存：加入DMSO分装于小安瓿内保存于液氮中
9、单抗的生产： 动物体内生产系统：小鼠腹腔，收腹水，腹腔注射液体石蜡或降植烷，刺 激腹水产生 细胞培养产生系统：单层细胞培养或悬浮培养。关键：提高培养液中的细 胞密度
聚合酶链式反应（PCR）
PCR的反应体系
RT—PCR 原位PCR 反向PCR 不对称PCR
荧光PCR
巢式PCR 定量PCR
重组PCR
多重PCR 免疫-PCR
定性、定量、定位 假阳性、假阴性
可重复性
五、基因芯片（Gene chip）
将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固 定于支持物上，然后与待检测样品中的基因按碱基配对原理进行杂交， 再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系 统对每一探针上的荧光信号作比较和检测，从而迅速得出所要的信息。
转印杂交 （transfer hybridization ） 原位杂交（in situ hybridization ）
应用： 难以培养的病原体检测 牛白血病、猪痢疾、牛和猪钩端螺旋体病、牛副结核
DNA 样品 限制性内切 酶消化
两部分工作
DNA 探针
标记
变性
琼脂糖凝胶电泳
杂交 转移印迹 胶 膜
暴光
X-ray 片
Ig相关分子

将抗体分子的部分片段（如V区或C区） 连接到与抗体无关的序列上（如毒素）， 就可创造一些Ig相关分子。
– “生物导弹”，毒素取代Fc,通过高变区结 合特异抗原，连接上的毒素可直接运送到靶 细胞表面
噬菌体抗体（phage antibody）

通过PCR将全套人抗体重链和轻链V区基 因克隆出来，并在噬菌体表面表达、分 泌，经筛选后获得特异性抗体。

4、用生物工程的方法产生抗体
Fab片断由轻链和重链的VH及CH1部分 组成，作为一种催化剂，抗体酶有这样的 片断就行，无须完整的抗体分子。 通过噬菌体展示技术或全套抗体基因库筛 选高效催化抗体。
（三）催化抗体的应用
1、酶作用机理研究及制药、化工合成 及分析测试等 2、生物医学领域


2、RNA电泳图谱分析
分节段RNA病毒 不同病毒或相同病 毒不同毒株比较
reovirus
禽流感：8个片段 RNA 呼肠孤病毒：10～12 个节段 轮状病毒： 11个节段