生物传感器在检测食源性致病菌上的应用　王剑平１＊，李杜娟１　（１．浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州　３１００２９）　摘要：最主要的几种食源性致病菌像大肠埃希氏菌、李斯特氏菌和鼠伤寒沙门氏菌等不仅威胁到人们的生命安全，还会造成巨大的社会经济损失。

生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透成长起来的高新技术，具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂的体系中进行在线连续监测的特点。

根据生物传感器的信号转化器可分为光学式、电化学式、压电式生物传感器等；在检测食源性致病菌方面生物传感器表现出能够满足实际应用的发展潜力，但是生物传感器目前仍面临并需要解决一些问题.最后提出了实际检测应用中对生物传感器的要求。

关键词：致病菌，生物传感器，光学，电化学，压电中图分类号：TS207.30　引 言　近年来，食源性致病菌引发的流行性疾病越来越受到社会关注。

大肠杆菌Ol57：H7（E.coli Ol57：H7）、李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）等被认为是几种最厉害的食源性致病菌，它们引起的疾病，严重时都可导致死亡。

美国疾病控制和预防中心（CDC）估计，美国每年由食源性致病菌造成大约7,600万例疾病，32.5万例住院治疗，5200例死亡[1]。

其中由已知致病菌引起的食源性疾病大约1,400万例，6万例住院治疗和1800例死亡。

这表明致病菌是传染疾病的一种根源。

美国农业部（USDA）估计，由食品致病菌造成的医疗花费和生产力损失，每年将会达到29-67亿美元[2]。

致病菌入侵到美国的牲畜、家禽和农作物，不仅使食品的价格上升，还降低了食品出口量，这将使国家损失数十亿美元的税收[3]。

在我国，1986年在江苏徐州市首次发现了E.coli Ol57：H7的感染病人[4]，后来又在山东省发现了 E.coli Ol57：H7，1999至2000年，在中国东部部分地区发生了较大规模的E.coli Ol57：H7爆发，可能是迄今为止世界上流行规模最大的一次，对我国经济造成了重大损失。

因此，建立一种快速、方便、可靠的食品安全检测技术，以防止传染疾病和经济损失是一个迫切的需求。

∗　几种快速检测技术已经用于检测致病菌，包括聚合酶链反应法（Polymerase Chain Reaction ，PCR）[5,6,7,8,9]，酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent∗收稿日期：修订日期：项目基金：美国农业部国际合作项目（USDA/FAS/ICD/RSED/SCRP）作者简介：王剑平（1960－），男，博士，教授，博士生导师，研究方向：农产品无损检测和生物传感器。

通讯地址，浙江大学生工食品学院杭州市凯旋路268号，310029。

Email: jpwang@ Asay ，ELISA）[10,11]。

因为PCR和ELISA需要通过富集、分离、形态学检测、生物化学和血清学测试来鉴别食品致病菌，所以这些方法虽然比传统方法需要的检测时间缩短了不少，但还是达不到实际中的要求。

实践中需要更快、更灵敏、更可靠的检测技术，生物传感器就是一种有望达到这种要求的技术。

１生物传感器的基本原理生物传感器是将生物识别元件和信号转换元件紧密结合，从而检测目标化合物的分析装置。

生物传感器的结构一般由两个主要组成部分：其一是生物分子识别元件（感受器），是具有分子识别能力的生物活性物质（如组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、酶、抗体、核酸、有机物分子等）；其二是信号转换器（换能器），主要有电化学电极（如电位、电流的测量）、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振器件等。

如Fig1所示，其基本原理为：当待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物（或光、热等）通过信号转换器转变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测的目的。

生物传感器的选择性取决于它的生物敏感元件，而生物传感器的其他性图１　生物传感器原理图　Fig 1. Principle of operation for a biosensor生物传感器与其他化学、物理传感器的关键不同之处在于其识别元件在性质上是生物质。

生物传感器具有选择性好、灵敏度高、样品用量小、分析速度快、专一性强、成本低、能在复杂的体系中进行在线连续监测的特点；生物传感器的高度自动化、微型化与集成化，减少了对使用者环境和技术的要求，适合野外现场分析的需求，在生物、医学、环境监测、食品、医药及军事医学等领域有着重要的应用价值，已引起世界各国的极大关注。

　生物传感器有多种分类方法，根据生物传感器的信号转换器可分为电化学式生物传感器、光学式生物传感器、压电式生物传感器等。

　２　光学式生物传感器当换能器使用光敏元件，根据光学原理工作时，就构成了光学式生物传感器。

2001年，Koubova V等人[12]实现了用表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）传感器实时检测肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）和单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）。

该传感器的检测限是106 cells/mL，灵敏性和标准ELISA相当。

Leonard P等人[13]在2004年采用BIAcore3000生物传感器来检测Listeria monocytogenes。

BIAcore3000生物传感器是一种基于表面等离子体共振现象的商业生物传感器。

他们首先将Listeria monocytogenes细胞和抗体孵育一小段时间，接着用逐步离心法来分离未被绑定的抗体。

自由抗体流过经修饰的传感芯片表面，由此产生的响应信号与抑制细胞的浓度成反比。

三十分钟内，检测限可达到1×105 cell/mL。

研究表明，该方法简单、快速，并且只需少量的样品准备。

这种检测方法能够在样品有限的情况下，实现快速、灵敏的致病菌检测。

Zourob M等人[14]用金属包层的漏波导传感器装置（LWD）来检测枯草芽孢杆菌黑色变种，检测限为104 孢子/mL。

今年，Subramanian A等人[15]研究了表面等离子体共振（SPR）免疫传感器检测E. coli O157:H7的灵敏性和特异性。

他们采用自组装膜法固定抗体，把纯单克隆或者多克隆抗E. coli O157:H7抗体固定到传感器芯片表面，并对E. coli O157:H7进行直接检测和抗体夹心检测。

他们研究了蛋白G检测的效果和不同浓度的一抗、二抗下“三明治”检测的效果。

研究结果显示：“三明治”检测方法中，该传感器的检测限可达到103 cfu/mL，且对肠炎沙门氏菌有很高的特异性。

直接检测和蛋白G检测的检测限分别是106 cfu/mL和104 cfu/mL。

因此，他们得出结论：基于烷烃硫醇自组装膜的SPR生物传感器采用“三明治”方法，能够快速、特定的检测E. coli O157:H7。

Liu Y等[16]用免疫磁分离技术和吸光率的测量实现了Escherichia coli O157:H7的快速检测，总检测时间不超过2小时。

Su X等[17]研究了一个灵敏的、特定的、快速检测E. coli O157:H7的方法，该方法同时采用量子点（QDs）作为荧光标记和免疫磁性分离技术。

研究结果表明：在103－107 cfu/mL范围内，荧光发射强度的峰值和E. coli O157:H7 的初始细胞浓度成比例，检测限比FITC方法至少要低100倍。

总检测时间少于2个小时。

３ 电化学式生物传感器　电化学式生物传感器是指由生物材料作为敏感元件，电极（固体电极、离子选择性电极、气敏电极等）作为转换元件，以电势、电流或阻抗等为特征检测信号的传感器。

３．１电极阵列2004年， Yang L等人[18]将抗体固定到铟锡氧化物交叉阵列（IDA）微电极上，建立了一个快速检测Escherichia coli O157:H7的无标记电化学阻抗免疫传感器。

研究结果显示抗体的固定和E. coli细胞绑定到IDA 微电极表面上，都会使电子传递阻抗增加。

在[Fe(CN)6]3-/4- 作为氧化还原对存在的情况下，用电化学阻抗谱直接测量电子传递阻抗。

在4.36×105－4.36×108 cfu/mL范围内，电子传递阻抗和E. coli细胞浓度有关，该传感器的检测限为106cfu/mL。

同年，他们又实现了根据细菌生长过程中阻抗的变化，用交叉微电极（IMEs）来检测鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）[19]。

在S. typhimurium 生长的过程中，他们记录了四个频率（10Hz、100Hz、1kHz、10kHz）下的阻抗生长曲线，即对照细菌生长时间的阻抗。

他们发现，细胞浓度达到105－106cfu/mL时阻抗才会发生变化，10Hz时阻抗发生最大的变化。

细菌生长过程中阻抗的变化可以用一个等效电路（包括双层电容、一个绝缘电容、一个介质阻抗）解释。

研究发现t D（检测时间，频率开始变化的时间，从10Hz时的阻抗生长曲线上获得）和介质与牛奶里S. typhimurium细胞初始值的对数成线性关系。

并得出研究结论：纯介质和牛奶样品里的细胞数量在4.8×105－5.4×105 cfu/mL之间时，它们的回归方程分别是：t D＝－1.38 log N＋ 10.18 ，R2＝ 0.99 ，和t D＝－1.54 log N＋ 11.33 ，R2＝ 0.98 ；细胞初始数量是4.8和5.4×105cfu/mL时，检测时间分别是9.3小时和2.2小时；可检测只含1个细胞的样品。

次年，Radke S等人[20]建立了一个检测 E. coli O157:H7的高密度微电极阵列生物传感器。

该生物传感器由100个硅片制作而成，每两个硅片之间用2um厚的热氧化物作为绝缘层，每个硅片的活性面积为9.6 mm2，由此组成了一个相互交叉的金电极阵列。

传感器表面用双功能键使其功能化，以绑定多克隆抗体，形成生物传感表面。

该生物传感器在样品里测试时，悬浮在其中的细菌结合到固定的抗体上。

在100Hz－10MHz范围内，测量细菌引起的阻抗变化。

该传感器的检测范围为104－107 cfu/mL，并具备在食品样品中检测细菌的能力。

３．２单电极Ruan C等[21]建立了一个在线检测介质中Salmonella typhimurium 的新方法，即在细菌繁殖过程中，用电化学伏安分析仪测量循环伏安中阴极氧的峰值电流。

细菌生长过程中某一刻的快速耗氧，导致曲线上的急速下降。