2 微孔板生物测定法
微孔板生物测定法是 Berridge 和 Barret 在 1952 年提出的另一种基于抑菌活性的半定量筛选方法，基 本原理是根据菌体浓度在一定范围内与透光度之间 存在线性 关 系，确 定 存 在 线 性 关 系 的 菌 体 浓 度 范 围 （ 或透光度范围） ，从而建立起菌体浓度（ Log10C） 和 透光度（ T% ） 的线性关系［13］。Bhunia 等人采用了 96 孔板法测定发酵上清液中细菌素的活性，其本质是通 过连续的梯度稀释，找到最低抑制浓度或 50% 抑制 浓度，然后以这个浓度作为任意单位，通过稀释倍数 来计算原溶液中细菌素的效价［14］。Turcotte 等对这 种多孔平板法作了改进，对指示菌的浓度和培养时间 进行了优化，改变了多孔平板法作为一种半定量方法 的局限性。研究表明，96 孔板法的检测极限（ 0. 08 ～ 60 μg / mL） 是琼脂扩散法（ 0. 3 ～ 10 μg / mL） 的 4 ～ 6 倍［15］。
综述与专题评论
产细菌素乳酸菌筛选方法的研究进展*
侯亚文1 ，易华西1 ，杨艳艳1 ，张兰威1 ，马放2
1（ 哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江 哈尔滨，150090） 2（ 哈尔滨工业大学市政环境工程学院，黑龙江 哈尔滨，150090）
摘 要 近年来新型的乳酸菌细菌素不断出现，而对这类乳酸菌的筛选方法也从传统的平板筛选法，逐渐向基 于生物信息学的高通量、快速筛选模式发展。文中比较了琼脂扩散法、比浊微孔板生物测定法、生物荧光法、基 于 PCR 方法的快速筛选等方法的优缺点以及产细菌素乳酸菌的快速筛选策略，期望对新型乳酸菌细菌素的开 发和利用提供新思路。 关键词 细菌素，乳酸菌，筛选方法
菌的生长显示抑制效果的一种定性分析抑菌谱的筛 选方法，是 Tramer 等人 1964 年建立起来的，适用于 不透明、不 能 使 用 浊 度 分 析 法 分 析 的 样 品［4］。 常 用 的杯碟法（ well test） ，滤纸片法（ disc diffussion） 和点 种法（ spot inoculation） 均属于此类方法。Wolf 和 Gibbons［5］对琼脂扩散法进行了改进，在培养基中加入吐 温 20 或吐温 80 加快抗菌肽在琼脂中的扩散，提高了 其灵敏度和准确性。目前，国内外大多数产抗菌肽乳 酸菌的筛选均建立在该方法的基础上，Nabil Ben 利 用琼脂扩散法在当地发酵食品中进行产抗菌肽乳酸 菌的初筛，从 135 株乳酸杆菌筛选出 31 株产抗菌肽 的乳酸菌，经鉴定为 28 株植物乳杆菌和 3 株发酵乳 杆菌［6］。Svetoslav 利用琼脂扩散法从一种植物中分 离出 1 株具有抗乳酸菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克 雷伯氏菌、李斯特菌诺克（ Listeria innocua） 、李斯特菌 伊万诺夫（ Listeria ivanovii） 、单核细胞增生李斯特氏 菌等致病菌的戊糖片球菌 ST44AM，所产生的细菌素 经鉴定为片球菌素 PA － 1，它是一种 ClassⅡ型细菌 素［7］。胡淑敏利用的牛津杯双层平板法也属于此类 筛选方法［8］，他从 70 株乳酸菌中筛选得到 2 株具有 较高抑菌活性的乳酸菌 LAB30 和 LAB211。黄新凤 （ 2009） 等通过抑菌法从生牛奶中筛选出 1 株对多种 G + 细菌、G － 细菌、酵母菌和丝状真菌的乳酸乳球菌 乳酸亚种菌株（ Lactococcus lactis subsp. lactis） ，并命名 为 MB191［9］。
3 生物荧光法
生物荧光是活的生物组织体内由于代谢活动产 生的一种发光现象。将编码荧光素酶的基因克隆到 指示菌中，可用于抗菌作用的敏感性检测。利用细菌 的荧光素酶基因克隆到金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和 沙门氏菌 等 指 示 菌 中，使 得 指 示 菌 具 有 荧 光 酶 基 因 luxAB 和负责合成长链脂肪醛的 luxCDE 基因，用于 产生荧光，不需要外源性醛的加入就可以使荧光稳定 产生，无需平板计数和过夜培养就可以快速检测出抗 菌作 用。该 方 法 已 经 用 于 检 测 乳 酸 菌 的 抗 菌 作 用［16］。另外，Norma 等人研究了一种基于黄连素流 入受损细胞后 的 荧 光 放 射 新 型 细 菌 素 筛 选 方 法［17］。 黄连素是一种位于细胞内的发荧光的生物碱，尽管这 种特性的 机 制 还 不 是 很 清 楚，但 它 与 生 物 分 子 包 括 DNA 和葡糖胺多糖相结合时能发出荧光已经得到确 认。黄连素分子量小于 ATP，可以通过气孔或者细胞 质膜破裂后进入细胞［18 － 19］。鉴于此，由细菌素导致 的细胞膜破坏会引起黄连素的细胞内定位，同时使细 胞发出荧光。因此，该方法的研究可以用来筛选作用 机制为形成膜孔或破坏细胞膜完整性的产细菌素的 乳酸菌。
1 琼脂扩散法
琼脂扩散法是利用待检测菌在琼脂表面对指示
第一作者： 硕士研究生 （ 易华西副教授为通讯作者，E-mail： yihx2006@ yahoo． com． cn） 。 * 国家自然基金项目（ 30900996） ； 中国博士后科学基金特别资助 项目 （ 2012T50346 ） ； 高 等 学 校 博 士 学 科 点 专 项 科 研 基 金 （ 20112302110051） 收稿日期： 2012 － 11 － 05，改回日期： 2013 － 01 － 25
一种乳酸菌可能力和所产细 菌素活力同时保持最佳状态，或者筛选出了高产细菌 素而无法发现其潜在的性能更加稳定的细菌素。因 而利用琼脂扩散法进行产抗菌肽乳酸菌筛选的同时
2013 年第 39 卷第 3 期（ 总第 303 期） 129
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
还应考虑培养基的优化。李秀凉等人利用 RSM 法优 化了副干酪乳杆菌 HD17 产细菌素的发酵培养基，找 到了最大细菌素产生区域进而确定了培养基最佳配 方［10］。Amelia 等人研究并评价了一些环境因素对植 物乳杆菌 17. 2b 产细菌素的影响，发现植物乳杆菌 17. 2b 产细菌素的条件对环境条件十分敏感，与细菌 生长并没有关系，细菌素产量达到最大时选择次优增 长温度 （ suboptimal growth temperatures） ，pH 值 选 择 高于最适生长时的 pH 值，不需要 NaCl［11］。最近的 研究表明，一些乳酸菌产细菌素的能力除了与环境因 素有关，还与培养基中 NaCl 浓度和有无表面活性剂 有关。Castro 等人发现发酵干肠中分离出的乳酸菌 在冷藏条件下添加 3% 的 NaCl，以及表面活性剂吐温 20 和聚氧乙烯脂肪醇醚 35，有利于乳酸菌产出热稳 定性强的乳酸菌素［12］。
生物荧光法具有快速、准确等优点，可以在 1 ～ 2 h 内得到结果。但这种方法的前提是必须先构建含 有荧光酶 基 因 的 基 因 重 组 指 示 菌 菌 株，技 术 要 求 较 高，虽然从理论上这种方法可作为筛选产细菌素乳酸 菌的快速 甚 至 高 通 量 检 测 方 法，但 由 于 指 示 菌 种 类 （ 食品腐败菌或致病菌） 繁多，实际上不可能一一构 建所有的指示菌重组菌株，这种方法不适于用来筛选 产广谱细菌素的乳酸菌。
4 基于 PCR 技术的快速筛选方法
随着在世界范围内对不同乳酸菌菌株基因组测 序的完成，基因组序列在挖掘新型高效的细菌素方面
130 2013 Vol. 39 No. 3 （ Tota l 303）
综述与专题评论
扮演着重要的角色，使得利用生物信息学的方法预测 和寻找 新 型 细 菌 素 成 为 可 能。 根 据 已 知 的 细 菌 素 DNA 序列设计保守的 PCR 引物或制备寡核苷酸探 针，可以在大范围内的乳酸菌群中挖掘出依赖功能性 测定时不易发现的细菌素［20］。其中，基于 PCR 方法 的快速筛选可以作为生态学研究中的有效手段，可以 鉴定出产 细 菌 素 的 益 生 菌，并 将 其 应 用 在 食 品 工 业 中。Michat 等人基于 class IIa 型细菌素编码基因，设 计了编码 class IIa 细菌素基因的 7 对引物，利用 PCR 方法从 40 种奶酪样品中筛选出了产 class IIa 细菌素 的乳酸菌［21］。Sunita 等人用各种引物的 PCR 阵列鉴 定出了 LAB Bac + 结构基因，结果表明细菌素 PCR 阵 列可以成功地扩增来自乳酸杆菌、乳球菌以及片球菌 中的细菌素结 构 基 因［23］，该 研 究 建 立 了 一 种 微 平 板 细菌素 PCR 阵列，可以快速扩增细菌素结构基因。 另外，建立在 PCR 方法上的快速筛选还可以用来分 析乳酸菌细菌素的基因簇多样性，而基因簇的多样性 或操纵子的多态性可以反映细菌素是否具有广谱抗 菌性。Nabil 等人利用 PCR 方法研究了已报道的产细 菌素植物乳杆菌，对植物乳杆菌素操纵子的基因图谱 进行了研究，用特定引物 PCR 扩增，将扩增产物用于 HindIII，EcoRI 和 KpnI 的限制性群集分析，发现了植 物乳杆菌 C11 中含有若干个植物乳杆菌素基因，而 发酵乳杆菌 EC11 包含了 plnDEFG 基因簇［24］。我们 课题组根据 ClassⅡa 抗菌肽 N-端保守氨基酸序列（ YGNGVCXXXXCXV-和-LDNAIE-） 这一特征设计简并 引物，建立了基于 Colony-PCR 法的产 ClassⅡa 抗菌 肽乳酸菌的快速筛选方法，结合琼脂扩散法，能够快 速有效 地 从 复 杂 的 环 境 中 分 离 出 产 细 菌 素 的 乳 酸 菌［22］。
借助于酶标仪，多孔平板法操作起来简便快捷、 省时、省力以及精密准确而使其在产细菌素乳酸菌的 筛选方面被广泛应用。但是，笔者研究发现由于装有
指示菌液的多孔平板必须在培养箱中静置培养 12 ～ 24 h，多孔平板孔洞中的菌液不可避免会挥发，在平 板孔盖上方容易产生水蒸气，一方面改变了孔洞里的 原始菌液体积，另一方面影响了比色结果，不能十分 精确地测定细菌素的浓度； 若稀释倍数产生 ± 1 的偏 差，会导致估算的原溶液细菌素的效价产生 2 倍甚至 更大的偏差。后来对其进行了改进，一方面在培养箱 中垫放湿纱布或湿海绵尽量减少培养过程中菌液的 挥发，同时在培养完毕后补加培养液，尽量减少误差。