同普通SDSPAGE类似， 只是一般在垂 直电泳系统中 无需浓缩胶。
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2. 蛋白质的分离
2-DE实验操作
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2. 蛋白质的分离
蛋白质检测
适用于质谱的染色方法
考马斯亮兰染色 ：灵敏度为10-30 ng，所需试剂少，操
作简便，无毒性，染色后背景及对比度好，与下游质谱兼 容，线性程度好。
银染：灵敏度为200pg，但其线性很差。普通银染过程中
因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容。
荧光染色：SYPRO染料，与银染相比灵敏度相当，操作
简便；但价格昂贵。
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2. 蛋白质的分离
电泳图谱分析
典型流程
凝胶图像的扫 描
图像加工
斑点检测和定 量
凝胶配比 数据分析
数据呈递和解 释
iTRAQ标记定量技术
iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation,同位素标记相对与绝对定量技术）技术是由 ABI公司于2004年开发，其标签试剂可与氨基（包括氨基
酸N端及赖氨酸侧链氨基）反应实现连接。
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1.
蛋白质组学简介
蛋白质调控及功能实现的复
杂性 DNA
Riboso me
tRN A mRN A Polypeptide
Protei n
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1. 蛋白质组学简介
蛋白质组学研究特点
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1. 蛋白质组学简介
蛋白质组学研究内容
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1. 蛋白质组学简介
蛋白质组学研究常用技术
优点：
分离能力高，技术比较 成熟
可同时提供等电点和分 子量信息
缺点：
• 不易获得低丰富度或者特 殊（过酸、过碱、难溶膜 蛋白等）的蛋白
• 操作繁琐，难以实现自动 化
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2. 蛋白质的分荧离 光差异双向电泳(2DDIGE)
在传统2-DE基础上引入三种 荧光标记(Cy2进行标记，实现 不同蛋白样品的同时分离、 单独成像、提高了重复性及 结果的可靠性。
蛋白质组学研究方法
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概要
1. 蛋白质组学简介 2. 蛋白质的分离 3. 质谱分析鉴定
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1. 蛋白质组学简介
组学时代（Age of omics）
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1. 蛋白质组学简介
从基因组学到蛋白质组学
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1. 蛋白质什组学么简介是蛋白质组（学） ？
蛋白质组(proteome = protein + genome)：一种细胞 、组织或生物体所表达的全套蛋白质，具整体性和动 态性。
。
凝胶
丙烯酰胺缓冲
液: CH2=CH-
CO-NH-R,
编辑版ppt R ：羧基或叔
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2. 蛋白质的分离
不同pH和长度的IPG胶（以BIO-
RAD的ReadyStrip™ IPG 胶条为例）
相对聚焦功率表示在使用不同长度或 pH 范围的 IPG 胶条时，在第一维中预
期获得的增强的分辨率。 为 7 cm pH 3–10 IPG 胶条任意分配基线聚焦功率 1.0
分离原理的多种色谱技术能够为
复杂蛋白质或多肽混合物的分析
提供足够分辨率，并能够直接同
质谱仪连用，实现样品制备分离
到质谱鉴定的自动化。或者色编谱辑版ppt
起始材 料
蛋白质的 溶解
酶解消 化
肽段混 合物
亲和色谱富集 （AC）
第一维：IEC
收
第二维：RP-
集
HPLC
组
分
ESI-MS
ESI-
MS/MS
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2. 蛋白质的分离
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2. 蛋白质的分离
2D-DIGE中内标的重要性
以样品中的蛋白点与其内 标的比值作为其定量数据
使不同凝胶之间的点的分 析和定量更加精确
使不同凝胶之间的匹配更 加可信
使实验间的误差与样品之
分间析的说明差：异区分开来
1)在没有内标的情况下，我们通过AB两
块胶的分析，会得出结论： 图中红色圆
常用软件
• PDQuest • ImageMaster 2D Elite
(MelanieTM)
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2. 蛋白质的分离
感兴趣蛋白点的切取
灭菌的0.2 ml枪头前端 剪去2cm左右，用此 枪头垂直戳向凝胶上 的蛋白点，旋转枪头 直至将胶点取下。注 意避免污染。
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2. 蛋白质双的分向离 凝胶电泳（2-DE）优缺 点
环所标记的蛋白质点在处理组(样品3和
样品4)表达量增高；
2)通过内标的校正，我们可以证明，这
实际上是由凝胶之间的误差造成的，并
不是样品之间的真实差异。
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2. 蛋白质的分离
多维液相色谱
亲和色谱（AC） 离子交换色谱（IEC） 反相高效液相色谱（
RP-HPLC）
顺序使用基于不同物理化学
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2. 蛋白质的分离
蛋白质的分离策略
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2. 蛋白质的分离
总蛋白质的提取（植物）
三氯乙酸（TCA）-丙酮法 苯酚法 裂解液法 尿素/硫脲法 KCl-醋酸铵甲醇法 改良丙酮沉降法 硫酸铵沉降法 直接提取法等
……
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2. 蛋白质的分离等电聚焦（Isoelectric focusing, IEF）
原理：根据蛋白质的等电点进行蛋白分离
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2. 蛋白质的固分离相pH梯度(Immobilized pH gradiet, IPG)胶
在IPG胶中，丙烯酰胺缓冲液通过乙烯键共价聚
合至固体凝胶聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。
通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，
因而可进行稳定的IEF分离达固到相 真正的平衡状态
蛋白质组学(proteomics) ：研究细胞组织或生物体蛋 白质组成及其变化规律的科学。
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Tip：蛋白质组学是研究领 域和方向，也是研究工具 和策略
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1. 蛋白质组学简介
蛋白质组学研究思路
表达蛋白质组 功能蛋白质组 蛋白质与蛋白质的相互作用 结构蛋白质组 蛋白质组与基因组、转录组、糖组、代谢组间的相互关系
以便计算其他胶条的相对聚焦功率 编辑版ppt
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2. 蛋白质的分离
宽pH、窄pH 范围胶条
宽pH梯度胶条应 用：
整个蛋白图谱
窄pH梯度胶条应 用：
提高分辨率
增加样品上样量
检测分析更多蛋 白
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2.
蛋白质的分离
SDS-PAGE
(SDS-聚丙烯酰胺
凝胶电泳)
根据蛋白质的 分子量进行蛋 白分离。