发酵中期染菌将会导致培养基中的营养物质大量消耗，并 严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。 有的染菌后杂菌大量繁殖，产生酸性物质，使pH值下降， 糖、氮等的消耗加速；菌体自溶，致使发酵液发粘，产生大 量的泡沫，代谢产物的积累减少或停止；
有的染菌后会使已生成的产物被利用或破坏。
发酵中期染菌一般较难挽救，危害性较大，在生产过程中 应尽力做到早发现、快处理。
二、染菌发生的不同时间对发酵的影响
（二）发酵前期染菌
在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，此 时期代谢的产物很少，相对而言这个时期也容易染菌。 染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争夺培养基中的营养 物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成。
二、染菌发生的不同时间对发酵的影响
（三）发酵中期染菌
第七章
发酵染菌及防治
黄小龙
发酵染菌：指在发酵过程中除生产菌以
外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使
发酵过程失去真正意义上的纯种培养。
第一节 发酵异常现象及染菌分析
一、种子培养和发酵的异常现象
二、染菌的检查和判断
三、发酵染菌原因分析
一、种子培养和发酵的异常现象

发酵过程中的种子培养和发酵的异常现象是指发 酵过程中某些物理参数、化学参数或生物参数发 生与原有规律不同的改变，这些改变必然影响发
5、菌体浓度过高或过低
在发酵生产过程中菌体或菌丝浓度的变化是按其固有的 规律进行的。
罐温长时间偏高，或停止搅拌时间较长造成溶氧不足， 或培养基灭菌不当导致培养条件较差，种子质量差菌体 或菌丝自溶等均会严重影响到培养物的生长，导致发酵 液中菌体浓度偏离原有规律，出现异常现象。


二、染菌的检查和判断
菌的特征进行区别、判断是否染菌。

如发现有与生产菌形态特征不一样的其它微生物的存在， 就可判断为发生了染菌。

此法检查杂菌最简单、最直接、最常用。必要时还可进行 芽胞染色或鞭毛染色。
2、肉汤培养法


通常用葡萄糖酚红肉汤作为培养基，将待测样品直接接入 经完全灭菌后的肉汤培养基中，分别于37℃、27℃进行培 养，随时观察微生物的生长情况，并取样进行镜检，判断 是否有杂菌。 肉汤培养法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，同时 此法也可用于噬菌体的检查。

要杜绝无菌空气带菌，就必须从空气的净化工艺和设备的 设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等 方面完善空气净化系统。
① 加强生产环境的卫生管理，减少生产环境中空气的含菌量，正确选择 采气口，如提高采气口的位置或前置粗过滤器，加强空气压缩前的预 处理，如提高空压机进口空气的洁净度。 ② 设计合理的空气预处理工艺，尽可能减少生产环境中空气带油、水量， 提高进入过滤器的空气温度，降低空气的相对湿度，保持过滤介质的 干燥状态，防止空气冷却器漏水，防止冷却水进入空气系统等。 ③ 设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器失效。
二、染菌发生的不同时间对发酵的影响
（一）种子培养期染菌
种子培养主要是使微生物细胞生长与繁殖，此时，微生 物菌体浓度低，培养基的营养十分丰富，比较容易染菌。
若将污染的种子带入发酵罐，则危害极大，因此应严格 控制种子染菌的发生。
一旦发现种子受到杂菌的污染，应经灭菌后弃去，并对 种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。
第三节
杂菌污染的预防
一、种子带菌及其防治 二、空气带菌及其防治 三、操作失误导致染菌及其防治 四、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防 治
一、种子带菌及其防治

原因 保藏斜面试管菌种染菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移
和接种过程染菌、种子培养所涉及的设备和装置染菌。

措施 ① 严格控制无菌室的污染，根据生产工艺的要求和特点，建立
三、发酵染菌原因分析

造成发酵染菌的原因很多，且因工厂不同而有所不同，
但设备渗漏、空气净化达不到要求、种子带菌、培养基
灭菌不彻底和技术管理不善等造成各厂污染杂菌的普遍 原因。
上海天厨味精厂谷氨酸发酵染菌分析 染菌原因 空气系统染菌 设备问题 管理和操作不当 染菌百分率/％ 32.05 15.46 11.34 染菌原因 补料、取样带菌 种子带菌 环境污染及原因不明 染菌百分率/％ 4.30 1.72 35.13
大都由于设备渗漏造成，应仔细检查阀门、罐体或罐器是否清洁等。 一般设备渗漏引起的染菌，会出现每批染菌时间向前推移地现象。
3、不同污染时间分析

染菌发生在种子培养阶段，或称种子培养期染菌。通常是 由种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不 当或设备因素等原因而引起染菌。 在发酵过程的初始阶段发生染菌，或称发酵前期染菌。大 部分也是由于种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及 接种操作不当或设备因素、无菌空气等原因而引起。 发酵后期染菌大部分是由空气过滤不彻底、中间补料染菌、 设备渗漏、泡沫顶盖以及操作问题而引起。
二、染菌发生的不同时间对发酵的影响
（四）发酵后期染菌
由于发酵后期培养基中的糖等营养物质已接近耗尽， 且发酵的产物也已积累较多，如果染菌量不太多，对发 酵影响相对来说就要小一些，可继续进行发酵。 对发酵产物来说，发酵后期染菌对不同的产物的影响 也是不同的，如抗生素、柠檬酸的发酵，染菌对产物的 影响不大；肌苷酸、谷氨酸等地发酵，后期染菌也会影 响产物的产量、提取和产品的质量。

注意点
① 无菌试验时，如果肉汤连续三次发生变色反应（红色→ 黄色）或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌 落的出现，即可判断为染菌。 ② 有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项 参数确有可疑染菌，并经镜检等其它方法确认连续三次 样品有相同类型的异常菌存在，也应该判断为染菌。 ③ 一般来讲，无菌试验的肉汤或培养平板应保存并观察至 本批（罐）放罐后12h，确认为无杂菌后才能弃去。 ④ 无菌试验期间应每6h观察一次无菌试验样品，以便能及 早发现染菌。
发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据进行判断。
在发酵过程中，如何及早发现杂菌的污染并及时采取措施 加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。 目前常用于检查是否染菌的无菌试验方法主要有显微镜检 查法、肉汤培养法、平板（双碟）培养法、发酵过程的异 常观察法（如溶氧量）等。
1、镜检法

用革兰氏染色法（Grams stain）对样品进行涂片、染色， 然后在显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌与杂
相应的无菌室，交替使用各种灭菌手段对无菌室进行处理。 ② 在制备种子时对砂土管、斜面、三角瓶及摇瓶均严格进行管 理，防止杂菌的进入而受到污染。 ③ 对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查，确保任何 一级种子均未受杂菌污染后才能使用。 ④ 对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理。
二、空气带菌及其防治
3、溶解氧水平异常
发酵过程中溶解氧水平发生异常变化一般就是发酵染菌发 生的表现。
由于污染的杂菌好氧性不同，产生溶解氧异常的现象也是 不同的。
杂菌是好氧性微生物时，溶解氧的变化是在较短时间内 下降，直到接近于零，且在长时间内不能回升； 杂菌是非好氧性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生 长，使耗氧量减少，溶解氧升高。
③ 代谢不正常
代谢不正常表现出糖、氨基氮等变化不正常，菌体 浓度和代谢产物不正常。
（二）发酵异常
1. 菌体生长差
2. pH值过高或过低
3. 溶解氧水平异常
4. 泡沫过多
5. 菌体浓度过高或过低
1、菌体生长差
由于种子质量差或种子低温放置时间长导致菌体数量 较少、停滞期延长、发酵液内菌体数量增长缓慢、外形 不整齐。
2、发酵染菌的规模分析
① 大批量发酵罐染菌
染菌时期 原因
发酵前期
发酵中、后期
种子带菌、连消设备染菌
如杂菌类型相同，一般是空பைடு நூலகம்净化系统存在空气 系统结构不合理、空气过滤介质失效等问题
② 部分发酵罐染菌
染菌时期
发酵前期 发酵后期
原因
种子带菌、连消系统灭菌不彻底 中间补料染菌，如补料液带菌、补料管渗漏
③ 个别发酵罐连续染菌（如果采用间歇灭菌工艺，一般 不会发生）
4、泡沫过多

一般在发酵过程中泡沫的消长是有一定规律的。
由于菌体生长差、代谢速度慢、接种物嫩或种子未及时 移种而过老、蛋白质类胶体物质多等都会使发酵液在不 断通气、搅拌下产生大量的泡沫。


培养基灭菌时温度过高或时间过长，葡萄糖受到破坏产 生的氨基糖会抑制菌体的生长，也会使泡沫大量产生， 从而使发酵过程的泡沫发生异常。
1、染菌的杂菌种类分析

对于每一个发酵过程而言，污染的杂菌种类的影响是不同的。
发酵产品 青霉素 链霉素 危害大的杂菌 细短产气杆菌 细短杆菌、假单胞菌、产气杆菌 危害小的杂菌 粗大杆菌 粗大杆菌
四环素 双球菌、芽胞杆菌、荚膜杆菌 杂菌 原因 柠檬酸 青霉 耐热的芽胞杆菌 培养基或设备灭菌不彻底、设备存在死角等 谷氨酸 噬菌体 种子带菌、空气过滤效率低、除菌不彻底、设备渗 球菌、无芽胞杆菌等 漏、操作问题等 真菌 设备或冷却盘管渗漏、无菌室灭菌不彻底、无菌操 作不当、糖液灭菌不彻底（糖液放置时间较长）等
三、操作失误导致染菌及其防治

通常对于淀粉质培养基地灭菌采用实罐灭菌较好，一般在升温前先通 过搅拌混合均匀，并加入一定量的淀粉酶进行液化；有大颗粒存在时 应先经过筛除去，再行灭菌；对于麸皮、黄豆饼一类的固形物含量较 多的培养基，采用罐外预先配料，再转至发酵罐内进行实罐灭菌较为 有效。
在灭菌升温时，要打开排气阀门，使蒸汽能通过并驱除罐内冷空气， 一般可避免“假压”造成染菌。 要严防泡沫升顶，尽可能添加消泡剂防止泡沫的大量产生。 避免蒸汽压力的波动过大，应严格控制灭菌温度，过程最好采用自动 控温。 发酵过程越来越多的采用自动控制，一些控制仪器逐渐被应用。一般 常采用化学试剂浸泡等方法来灭菌。