［中图分类号］ Ｒ３９２－ ３３
［文献标识码］ Ａ
［文章编号］ １６７２－ ２８０９（２００５）０６－ ０４２３－ ０３
Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒ ｅｐａｒ ａｔｉｏｎ ｐｒ ｏｃｅｄｕｒ ｅ ｏｆ ｆｉｒ ｓｔ ｌｏｔ ｎａｔｉｏｎａｌ ｒ ｅｆｅｒ ｅｎｃｅ ｏｎ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｅｒ ｔｕｓｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ ＨＯＵ Ｑｉ－ ｍｉｎｇ１， ＺＨＡＮＧ Ｓｈｕ－ ｍｉｎ１， ＬＩＡＮＧ Ｙａ－ ｗｅｎ１， ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ－ ｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００５０， Ｃｈｉｎａ）
作者简介： 侯启明（ １９５５－ ） ， 女， 研究员， 北京人， 研究方向： 百日咳等细菌疫苗的研究及质量控制。
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Ｄｒｕｇ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ， ２００５ Ｖｏｌ． ２ Ｎｏ．６
１．２．２ 解毒工艺比较： 对细菌培养物进行不同解毒 剂浓度， 以及在不同的解毒温度条件对样品所含毒 性的影 响的比较试验， 确定最终优化的生产工艺， 制备一批百日咳毒性国家冻干参考品。 １．３ 三种特异性毒性测定： 百日咳特异性毒性测定 方法是以日本国家毒性标准品 Ｌｏｔ２ （ 含量： 每支含 １３６８个 ＢＷＤＵ； ３６ 个 ＬＰＵ； ４８ 个 ＨＳＵ 毒 性 单 位 ） 为 对照， 按照 ２００５ 版《中国药典》三部中的方法， 分别 测定样品中所含的小鼠体重减轻单位 （ ＢＷＤＵ） 、小 鼠白细胞增多单位（ ＬＰＵ） 、小鼠组胺致敏单位（ＨＳＵ） 三种特异毒性单位。并对原始实验数据采用统计学 方法处理［２］。 ２ 结果 ２．１ 不同的生产工艺的初步比较研究 ２．１．１ 不同的生产工艺的设计： 工艺 Ａ： ＣＳ 菌种经 ＣＷＭ 培养基摇瓶震荡培养后，接种于 ３０ 万升发酵罐 通气搅拌培养，培养物经两次硫酸铵盐析、浸提， 沉淀 透析收获样品。工艺 Ｂ： ＣＳ 菌种经 ＢＧ 培养基克氏瓶 （ ２５％羊血） 培养，共限传三代，最后一代培养 ２４ｈ， 培 养物经 ０．１５％甲醛解毒（ ３６℃， ２４ｈ） 、洗涤离心后收获 样品。工艺 Ｃ： ＣＳ 菌种经 ＣＷＭ 培养基摇瓶震荡培 养， 离心收集菌体， 收获物经 ０．１％甲醛解毒 （ ３６℃， ２４ｈ） 、洗涤离心后收获样品。工艺 Ｄ： ＣＳ 菌种接种于 盐酸乳酪培养基摇瓶震荡培养洗涤、离心， 收获物经 ０．０８％甲醛解毒（ ３６℃， ２４ｈ） 收获样品。工艺 Ｅ： ＢＧ 培 养基（ ２５％羊血） － 全综合培养基（ ＳＳＭ） 振荡培养， 收 获 物 经 ０．０３％ 甲 醛 （ ３７℃， ２４ｈ） 解 毒 ２４ｈ， 经 过 ｐＨ７．２ＰＢＳ 洗涤 ２ 次，每次 ４℃， ７０００ 转离心 ２０ｍｉｎ， 加 入 １％硫柳汞； 经 ５６℃， ２０ｍｉｎ 水浴， 收获样品。
药品评价 ２００５ 年 第 ２ 卷 第 ６ 期
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·论 著·
第一代无细胞百日咳疫苗毒性国家参考品制备工艺的研究
侯 启 明 １， 张 庶 民 １， 梁 雅 文 １， 张 路 民 １， 项 美 娟 ２， 蒋 强 华 ２， 肖 詹 荣 ３， 付 春 晖 ３， 吴 玫 ４， 刘 志 强 ４， 孟 丽 ５ ， 李 松 ５， 金 于 兰 ６， 冯 洁 ６ ， 陈晓婷 ７ ， 孙晓林 ７ （１ 中国药品生物制品检定所， 北京 １０００５０； ２ 武汉生物制品研究所， 武汉 ４３００４６； ３ 北京生物制品研究所， 北京 １０００２４； ４ 长春生物制品研究所， 长春 １３００６２； ５ 成都生物制品研究所， 成都 ６１００６３； ６ 上海生物制品研究所， 上海 ２０００５２； ７ 兰州生物 制品研究所， ７３００４６） ［摘要］ 目的 筛选无细胞百日咳疫苗毒性国家参考品 的 最 佳 生 产 工 艺 。 方 法 选 用 百 日 咳 ＣＳ 菌 株 （ 编 号 ５８００３） ， 对不同的培养方式进行比较研究， 选择最佳毒性国家参考品的生产工艺。 结果 该参考品经过不同 培养方式比较后， 确定了最终生产工艺， 将培养的百日咳菌加入保护剂后分装制备成冻干品。 结论 该生产 工艺制备的样品含有较强的毒性， 同时能进行规模生产， 满足了毒性国家参考品各项检测指标的要求。 ［关键词］ 疫苗， 无细胞； 百日咳菌苗； 国家毒性参考品； 制备工艺
实验项目 生产方法
工艺 Ａ 工艺 Ｂ 工艺 Ｃ 工艺 Ｄ 日本参考品（ Ｌｏｔ １）
体重减轻 （ ＢＷＤＵ）
死亡 ７８．８ １５７．５ １２０ １１２
白细胞增多 （ ＬＰＵ） 死亡 １．３９ １．４２ １．７２ ５
组胺致敏 （ ＨＳＵ） 死亡 ３．４６ ３．７ ０．３８ ５
２．２ 不同生产和解毒工艺优化比较研究： 根据生产 工艺比较研究的基础上， 选择百日咳经典培养工艺 Ｂ 和工艺 Ｅ 进行进一步的研究， 重点是对其培养物 进行不同的解毒温度、不同的解毒剂浓度等进行优 化比较试验， 确定的最终生产工艺为： 选择百日咳 ＣＳ 株经 ＢＧ 培养基传 １ 代， 在经固碳培养基传 ２ 代， 接种于 ５ 万 ｍｌ 发酵罐通气搅拌培养后收获菌体悬 液， 收 获 物 悬 液 经 ４℃， ７０００ 转 ２０ｍｉｎ 离 心 ， 稀 释 成 细菌浓度 ８８０ 亿， 采用 ０．０３％甲醛含量在 ３７℃条件 下解毒 ２４ｈ， 然后样品经过 ｐＨ７．２ＰＢＳ 洗涤 ２ 次， 每 次 ４℃， ７０００ 转 离 心 ２０ｍｉｎ， 加 入 １％ 硫 柳 汞 ； 经 ５６℃， ２０ｍｉｎ 水浴， 过滤后稀释成细菌浓度 ４４０ 亿， 加 入 １％明胶冻干。该方法制备的毒性参考品即能将细 菌灭活， 又能保持较强的的三种特异性毒性单位， 而 且可以满足大规模生产， 储备足够的数量， 满足制备 国家参考品的必要条件。结果见表 ２
工艺， 去除了大多数毒性因子的新型组分疫苗， 该疫 苗不仅具有较高的免疫原性， 而且关键是解决了全 细胞百日咳疫苗接种婴幼儿后容易引起严重副反应 的难题， 只有少数人接种后可能产（ 下转第 ４４９ 页）
药品评价 ２００５ 年 第 ２ 卷 第 ６ 期
［２９］ ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ＆ ＵＰＪＯＨＮ ＣＯ （Ｇｏｒｄｅｅｖ ＭＦ， Ｓｉｎｇｈ Ｕ， Ｐａｔｅｌ ＤＶ， Ｍａｙ ＰＤ）．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ １－ ａｒｙｌ ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｏｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ． ＷＯ－ ２００４０３３４４９（２００４）．
２．１．２ 不同的生产工艺样品的毒性检测结果： 对四 种生产工艺生产的样品进行三种特异性毒性检测，分 析结果发现： 四种方法所制备的毒性参考品样品所 含的 ＢＷＤＵ、ＬＰＵ 和 ＨＳＵ 三种特异性毒性单位数都 很低， 说明其制备工艺需要进一步优化。结果见表 １
表 １ 不同的生产工艺样品的毒性检测结果
２５℃２４ｈ
６９
３．２
４．５
３７℃２４ｈ
１０１
２．７
３．７
０．０３％
２５℃２４ｈ
５６
２．９
２．０
３７℃２４ｈ
５２
２．６
３．１
日本参考 ｌｏｔ２
１１４
３
４
３ 讨论 ３．１ 全细胞百日咳疫苗是一种全菌体疫苗， 含有 ９ 种以上的抗原， 据报道 １０￣３０％接种者可能发生全身 或局部的严重反应。无细胞百日咳疫苗是经过纯化
我国的无细胞百日咳疫苗的毒性检测方法和质 量指标是参照日本国家生物制品规程 （ １９８７ 版） 而 建 立 的 ， 并 且 已 经 纳 入 ２００５ 版 的《中 国 药 典 》三 部 中， 因此研制我国自己的无细胞百日咳疫苗国家毒 性标准品成为当务之急。
中国药品生物制品检定所于 １９９８ 年在上海举 办由北京、长春、成都、兰州、上海和武汉六个生物制 品研究所参加的《无细胞百日咳菌苗参考品研制》研 讨会， 聘请日本 ＮＩＩＤ 的掘内善信博士， 制定无细胞 百日咳国家毒性标准品研制方案， 启动了毒性国家 参考品的研制工作。通过参与者多年的分工合作， 经 过不同生产工艺的反复比较试验， 优化出最佳的制 备工艺， 研制了一批无细胞百日咳国家毒性参考品。
［３３］ ＭＯＲＰＨＯＣＨＥＭ ＡＧ ＦüＲ ＫＯＭＢＩＮＡＴＯＲＩＳＣＨＥ ＣＨＥＭＩＥ （Ｈｕｂｓｃｈｗｅｒｌｅｎ Ｃ，Ｓｐｅｃｋｉｌｉｎ Ｊ－ Ｌ， Ｂａｅｓｃｈｌｉｎ ＤＫ， Ｌｏｃｈｅｒ Ｈ， Ｓｉｇｗａｌｔ Ｃ）．Ｕｓｅ ｏｆ ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ－ ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ ｈｙｂｒｉｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔ－ ｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｈｒａｘ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ． ＷＯ－ ２００４０９６２２１ （２００４）．
表 ２ 不同生产和解毒工艺优化比较研究结果
生产工艺
细菌数（ 亿）
甲醛浓度
解毒条件
原液灭活
ＢＷＤＵ
ＬＰＵ
ＨＳＵ
工艺 Ｂ
３００
０．０１％
２５℃２４ｈ
５６℃， ２０ｍｉｎ
２０２
２．９
１０
３７℃２４ｈ
２１９
２．１
１１Biblioteka ０．０３％２５℃２４ｈ
２１３
２．１
８．２
３７℃２４ｈ
２６９
１．７
９．５
工艺 Ｅ
１２００
０．０１％
１ 材料与方法 １．１ 菌种： 百日咳杆菌 ＣＳ 株（ 编号 ５８００４， 血清型因 子： １、２、３） 作为制备毒性国家参考品的菌株。该菌株 是由北京生物制品研究所何秋民教授于 １９５７ 年从 北京儿童医院百日咳患者鼻咽部分离出的一株百日 咳杆菌流行株［１］。 １．２ 工艺 １．２．１ 制备工艺比较： 对四种不同培养工艺进行比 较研究， 工艺 分 别 为 工 艺 Ａ： ＣＷＭ 培 养 基 、硫 酸 铵 浸提工艺； 工艺 Ｂ： 百日咳杆菌经典培养法； 工艺 Ｃ： ＳＳＭ 培养基的全菌 体 培 养 工 艺 ； 工 艺 Ｄ： 盐 酸 乳 酪 培养基的全菌体培养工艺； 工艺 Ｅ： 全综合培养基 （ ＳＳＭ） 振荡培养工艺。