虾青素分析测定方法的研究【摘要】选择分光光度法及高效液相色谱法对测定虾青素的分析条件进行研究，从而得出最佳的测定条件。
用分光光度法和高效液相色谱法测定虾青素，标准曲线的回归方程的r2都超过了0.99。
用分光光度法测定虾青素，回收率范围为99.3-101%，相对标准偏差rsd值为0.78-1.3%；用液相色谱法测定虾青素，回收率范围为100-102% ，相对标准偏差rsd为0.62-1.4%。
这些值都在定量分析所要求的阈值范围内，可以用于定量分析。
【关键词】分光光度法；高效液相色谱法；虾青素abstract： choice two based on the spectrophotometry and high performance liquid chromatography (hplc) were developed for determination the astaxanthin. and the optimum conditions was investigated in detail. the total amount of astaxanthin was measured by spectrophotometry, the recoveries were in the range of 99.3-101%, and rsd were in the range of 0.78 %-1.3 %. also the astaxanthin was determined by hplc, and the recoveries were in the range of 100% -102%, rsd were in the range of 0.62%-1.4%. all these values were within the range of permissive threshold value on quantitative analysis, which showed that it’s feasible for measuring the content of astaxanthin by these two methods.key words: spectrophotometry；hplc；astaxanthin从动植物及菌类中提取虾青素目前还处于实验研究的基础阶段，要实现产业化生产虾青素，还必须对其提取工艺进行广泛深入的研究。
要开展这方面的研究，必须建立起快速、高效、简便的虾青素分析方法。
虾青素是一种类胡萝卜素[1]，分光光度法和高效液相色谱法是常用的两种类胡萝卜素分析方法[2,3]，这两种方法各有特点：类胡萝卜素分子因其分子结构中的共轭双键体系及离域化的π电子，在可见光区表现出强吸收带，且每种类胡萝卜素分子的最大吸收峰位置与紫外可见光光谱的精细结构都是具有特征性的。
由于类胡萝卜素分子的这种光吸收性质，溶液中的类胡萝卜素一般服从beer-lambert定律，所以通过分光光度法可实现对其精确的定量分析[4]；高效液相色谱法具有分离速度快，在线检测（如uv 检测器），灵敏度高等优点，是美国nfia（美国饲料协会）规定的测定方法。
本工作旨在通过对分光光度法和液相色谱法测定虾青素的研究，从而建立快速、有效、准确的测定虾壳中虾青素的方法。
一、材料和方法（一）材料（1）仪器：721型分光光度计（上海精科食品厂）高效液相色谱仪（日本岛津公司）ｃ18 色谱柱：250 mm×4.6 mm（迪马公司）恒温箱 202-1 型(上海市上海县试验仪器厂)ja2003 上皿电子天平（上海天平仪器厂）（2）试剂：虾青素标准品（分析纯，美国sigma公司）；乙腈（色谱纯）；甲醇、无水乙醇、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、石油醚等均为分析纯。
（二）实验方法（1）分光光度法准确称取一定量的虾青素纯样品多份，分别用乙醇有机溶剂溶解后各自配制成1.0μg/ml、2.0μg/ml、3.0μg/ml、4.0μg/ml、5.0μg/ml、6.0μg/ml的标准溶液，用721型分光光度计测定不同波长下的吸光度。
在最大波长下，以试剂空白调零，测其吸光度。
以虾青素标准溶液的浓度为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）高效液相色谱法1. 色谱工作条件色谱柱：c18（250mm×4.6mm）。
流动相：乙醇：甲醇：二氯甲烷＝75：15：10（v/v），流速为1.0ml/min。
柱温：室温。
检测波长为480nm，进样量20μl。
2. 标准工作曲线绘制称取一定量的虾青素标准溶液，用甲醇配制浓度分别为1.0 μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml、6.0μg/ml、8.0μg/ml、10.0 μg/ml标准溶液，分别取20μl进样，根据峰面积与相应的浓度进行线性回归，绘制标准工作曲线。
二、结果与分析（一）分光光度法分析虾青素（1）虾青素标准样品在乙醇溶剂中的最大吸收波长我们将虾青素标准样品溶解在乙醇溶剂中，在400 nm 至700 nm 范围内测其吸光度，结果如图1。
从图中可以看出，虾青素标准样品在乙醇溶剂中的最大吸收波长为474 nm。
（2）虾青素标准样品在乙醇有机溶剂中的标准曲线准确称取一定量的虾青素纯样品多份，分别用乙醇有机溶剂溶解后，以试剂空白调零，用721型分光光度计测其吸光度。
以虾青素标准溶液的浓度为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
结果见图2。
条件：测定波长λ=474nm从图2中可以看出，在乙醇溶剂中虾青素浓度与其吸光度具有良好的线性关系（相关系数r2大于0.999），通过测得的吸光度按其线性回归方程可计算虾青素的浓度。
（3）回收率和精密度试验精密称取虾青素10.00mg，置100ml容量瓶中，分别加入浓度为100μg/ml虾青素标准储备液2ml、3ml、4ml，用乙醇溶解并稀释至刻度。
用新建立的方法对其进行分析，计算回收率及精密度值，实验结果如表1所示。
条件同图2从表1可以看出，虾青素的回收率范围为99.3%-101%，相对标准偏差rsd值为0.78%-1.3%。
（二）液相色谱法分析虾青素（1）检测波长的选择由于hplc的检测器是紫外检测器，综合考虑乙醇有机提取溶剂的最大吸收值及灵敏度，最终选择紫外检测波长为480 nm。
（2）色谱柱类型的选择利用高效液相色谱法测定色素的国家标准，大部分都是使用c8或c18为填料的反相液相色谱法，根据本实验室现有条件，采用了填料为c18的色谱柱来进行虾青素的液相色谱测定试验。
（3）流动相及其他色谱条件的选择甲醇、乙腈、四氢呋喃、水、甲醇、二氯甲烷、丙酮等是高效液相色谱法中最常用的流动相。
在反相色谱中极性大的组分因k值较小先流出色谱柱，极性较小的组分后流出。
流动相中有机溶剂的比例增加，流动相极性减小，洗脱力增强。
用水-甲醇作为流动相，显然比较经济，但我们试验的结果是出峰时间较后，且峰形较胖，所以本实验最终采用乙腈：甲醇：二氯甲烷＝75：15：10（体积比）作为流动相，超声波脱气，进样前样品用0.45 μm微孔滤膜过滤。
流速：1ml/min；检测波长为480nm；进样量：20μl；柱温为室温。
（4）标准工作曲线及色谱图如上1.2.2.2配制系列标准溶液，按给定色谱条件试验，以峰面积（y）对各组分浓度（x）求回归方程并绘制标准工作曲线，实验结果见图3。
由图3可知：虾青素浓度在1.0～10.0μg/ml 时，其浓度与峰面积成一直线关系。
在此浓度范围内，其标准曲线的回归方程为：y=139580x+3470，其中y：表示hplc峰面积；x 表示游离虾青素浓度（μg/ml）。
相关系数r＝0.9999，线性相关性很好。
图4为虾青素标准样品的高效液相色谱图。
由图中可知出峰时间为7.432 min 左右的峰为游离虾青素。
（5）回收率和精密度测定精密称取虾青素10.00mg，置100ml容量瓶中，分别加入浓度为100μg/ml虾青素标准储备液5ml、6ml，用流动相溶解并稀释至刻度。
用新建立的方法对其进行定量分析，每个样品平行做3个，计算回收率及精密度值，实验结果如表2所示。
条件同图4.从表2中可以看出，虾青素的回收率为100%-102%；虾青素测定的相对标准偏差rsd为0.62%-1.4%。
三、结论利用虾青素不溶于水，易溶于有机溶剂的特点，将虾青素标准样品经有机溶剂处理后，利用分光光度法和高效液相色谱法对其虾青素含量进行测定，其标准曲线的回归方程的r2都超过了0.999，线性良好，能用于定量分析测定。
用分光光度法测定虾青素，回收率范围为99.3-101％，相对标准偏差rsd值为0.78-1.3％；用液相色谱法测定虾青素，回收率范围为100-102%，相对标准偏差rsd为0.62-1.4%。
这些值都在定量分析所允许的阈值范围内[5]，说明用分光光度法和高效液相色谱法均可用来准确地测定虾青素。
参考文献[1] 李浩明，高蓝．虾青素的结构、功能与应用．精细化工．2003，20(01)：35-40．[2] 应国清，王晓艳，沈寅初．高效液相色谱法分析检测虾青素．食品与发酵工业，2001，27(11)：43-44．[3] j. j . scdmak, d. k. weerasinghe, s. o. jolly. extraction and quanfitafion of astaxanthin from phaffiarhodozyma.bioteehnol tech, 1990, 4:107-112.[4] 惠伯棣．类胡萝卜素化学及生物化学．北京：中国轻工业出版社，2005．[5] l. r. armenta, l. i. guerrero, s. huerta. astaxanthin extraction from shrimp waste by lactic fermentation andenzymatic hydrolysis of the carotenoprotein complex. j food chem, 2002, 67(3):1002-1006。