从动物组织中粗提线粒体
一、实验目的：
从动物组织中分离线粒体，以便线粒体功能分析实验。

二、实验准备
Lysis buffer、匀浆器、离心管、解剖器具
三、实验步骤：
1．实验前一天小鼠禁食过夜。

线粒体提取前所有溶液要冰上预冷。

2．解剖小鼠（~30g），快速取出肝脏，去除胆囊，放入50ml预冷的IBc烧杯中；
3．预冷的IBc洗去多余的血液。

洗4-5次至IBc澄清。

4．冰上将肝脏剪碎
5．倒掉清洗的IBc，加入新的5mlIBc，将上清转移至玻璃匀浆器
6．以1,600 rpm冰上匀浆3-4次，组织与缓冲液比例1：5-1：10间
7．匀浆液转移至50ml离心管，600g，离心10min 4 ℃
8．小心将上清转移至新的离心管600g，离心10min 4 ℃
9．小心将上清转移至新的离心管7000g，离心10min 4 ℃
10．倒掉上清，加入5ml预冷的IBc，洗一次，不要用枪头重悬
11．7000g，离心10min 4 ℃
12．去除上清，重悬底部的含有线粒体的颗粒。

用玻璃棒搅松底部的沉淀，不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬。

用1ml移液管重悬避免出现气泡。

13．转移至14ml离心管，置于冰上。

线粒体在1-3小时内用于实验，得到比较好的活性。

14．Bradford法测定线粒体浓度。

四、试剂配方
Buffer for cell and mouse liver mitochondria isolation (IBc)：100 ml
10 ml 0.1M Tris–MOPS
1 ml 0.1M EGTA/Tris
20 ml 1M sucrose
100 ml ddH2O，pH 7.4
储液：
1 M sucrose：
342.3 g sucrose
1L ddH2O
Mix, 20 ml分装-20 C保存.
0.1MTris/MOPS：
12.1 g Tris；
500ml ddH2O，MOPS 调pH 7.4，ddH2O 体积至1L保存于4 C.
0.1 M EGTA/Tris：
38.1 g EGTA；
500 ml ddH2O，Tris调pH 7.4 总体积至1L ，保存于4 C.
五、注意事项
1. 开始前将离心管预冷5min，所有步骤包括匀浆在4度冰上进行，降低磷脂酶和蛋白酶活性；
2．最后重悬时，用玻璃棒搅松底部的沉淀。

不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬，线
粒体在高浓度减少与氧接触时可长时间保持其功能。

用1ml移液管重悬避免出现气泡。

3. 此种方法得到的线粒体约为80 mg/ml,体积为1ml
六、参考文献
NATURE PROTOCOLS, VOL.2 NO.2, 2007。