用这些数据求丝氨酸脱水酶对磷酸吡哆醛的表观米氏常数。
解：1、v对[S]作图法:
v Vm 丙 酮 酸 M/20min 0.3 0.2 Vm 2
Vm=0.36 1/2Vm=0.18 Km=3.210-6 M
0.1
0 1
2
3
4 5
6
7 8 10-6 [S]
解2、1/v 对1/[S]作图法：
磷酸吡哆醛10 - 5（M） [S] 1/[S] 20分钟生成丙酮酸（M） v 1/v
二巯基丙醇
例2： 羟基酶的抑制
羟基酶: 有丝氨酸侧链上的羟基为必需基团的酶
有机磷(敌百虫、敌敌畏、对硫磷)不可逆抑制羟基酶的活性中心 RO
RO P
O
X
+ E—OH 羟基酶
RO
RO
P
O
O—E
+ HX
有机磷化合物 RO O
磷酰化酶(失活) O N
+
RO
P
+ + -CHNOH O—E N
-CHNO
P
OR
3
2 1 -4 -3 -2 -1 0
5
1/Vm=2.55 ; Vm=0.39
1ห้องสมุดไป่ตู้
2
3
4
5
-1/Km=-2.8510
1/[S]
Km=3.51 10-6
2、酶浓度对反应速度的影响

反应速度与酶浓度成正比：当[S][E],式中Km可以忽略不计。
v= v
k3[E][S]
Km + [S]
=k3[E]
o
（2）米氏方程推导

•
（3）米氏常数的意义
1、当反应速度等于最大反应速度一半时，即 V=1/2 Vmax,
Km=[S],米氏常数的单位为摩尔/L 。
•
2、不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常 数。
•
3、Km值只是在固定的底物，一定的温度和 pH 条件下，一定 的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。
氰化物或肼对芳香硫酸酯酶的抑制
可逆性抑制作用的动力学比较
作用特点 与I结合组分 动力学参数 表观Km 表观Vm 双倒数作图 斜率 纵轴截距 横轴截距 Km/Vm 1/Vm -1/Km Km(1+[I]/Ki)/V m 1/Vm 1/Km(1+[I]/Ki) Km(1+[I]/Ki)/V m (1+[I]/Ki)/Vm -1/Km Km Vm Km(1+[I]/Ki) Vm Km Vm/(1+[I]/Ki) Km/(1+[I]/Ki) Vm/(1+[I]/Ki) Km/Vm 无抑制剂 E 竞争性抑制 非竞争性抑制 E、ES 反竞争性抑制 ES

用下述单位表示反应速度v : nmol/ml /min, nmol/L/min, mol/L/min, mol/L/min 若10 l该提取液，在1 ml总反应体积中进行实验，其反应速 度是多少？
（1）米氏方程（Michaelis-Menten equation）
V=
米氏方程解释：
当[S]Km时，v=(Vmax/Km) [S], 即v 正比于[S]
当[S]Km时，v Vmax, 即[S]而v不变
Vmax [S] Km + [S]
米氏方程成立条件：
初速度为标准 单底物 稳态（steady state）
4、Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度 小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性 高。
•

米氏常数Km的测定：
斜率=Km/Vmax
1.0
测定Km和V的方法很多，最常用 的是Lineweaver–Burk的作 图法 — 双倒数作图法。 取米氏方程式的倒数形式：
1
0.8
（3）竞争性抑制(competitive inhibition)
• 概念
竞争性抑制剂的结构与底物结构相似，与底物竞
争同一种酶的活性中心,从而影响E与S的结合。 S
E I
E S
E+P
v E I
无I 有I
[S]
• 竞争性抑制作用过程 • 竞争性抑制的底物浓度曲线
• 竞争性抑制的动力学方程: v= Vmax[S] Km(1+[I]/Ki)+[S] 1 Km 1 [I] 1 (1+ ) + = v Vmax Ki [S] Vmax
B
8 10 pH
pH对某些酶活性的影响 A: 胃蛋白酶; B: 葡萄糖-6-磷酸酶
酶的最适pH: 酶催化活性最高时的pH。
部分酶的最适 pH 值
酶 最适 pH
胃蛋白酶
过氧化氢酶 胰蛋白酶 延胡索酸酶 核糖核酸酶 精氨酸酶
1.8
7.6 7.7 7.8 7.8 9.8
5、抑制剂对酶促反应速度的影响
抑制作用: 直接或间接地影响酶的活性中心,使酶
2+
、 K+、 Mn2+
四、酶活性测定



1、酶活性 酶的催化能力，以酶促反应速度来衡量。 2、酶活性单位 指酶促反应在单位时间（s,min,h）内生成 一定量（mg, μg, μmol）的产物或消耗一 定量的底物所需的酶量。



一个国际单位（IU ,1976年）：在特定条件下, 1 min内使底物转变 1μmol所需的酶量； 一个催量（kat）：在特定条件下,1 Sec内使底物转变 1mol所需的酶量 1I.U.=16.6710 -9 kat=16.67 10 -3 Kat； 1Kat =610 7 I.U. 酶比活：每毫克蛋白所含有的每活力单位数。
OR +E—OH
磷酰化酶(失活) CH3 解磷定
CH3
（2）可逆抑制(reversible inhibition) 抑制剂与酶以非共价键疏松结合引起酶活性的降低活丧失, 结 合是可逆的, 能够通过透析、超滤等物理方法使酶恢复活性。
可逆抑制类型：
竞争性抑制 (competitive inhibition) 非竞争性抑制（non-competitive inhibition） 反竞争性抑制（uncompetitive inhibition）
• 竞争性抑制的特征曲线：
1 v
[I]
正常
1 Vmax
-1 Km
[I] Km(1+ Ki )
-1
1 [S]
竞争性抑制的特点：

I与S分子结构相似； Vmax 不变，表观Km增大； 抑制程度取决于I与E的亲和力 ，以及[I]和[S] 的相对浓度比例。
例：
COOH CH2 CH2 琥珀酸脱氢酶 COOH CH
S Hg + 2H+ S S As-CH=CHCl + 2HCl
SH Cl
巯基酶
S
解毒方法：
COONa COONa + SH CHS CHS Hg
S
E S Hg +
CHSH CHSH COONa
SH
E
COONa
二巯基丁二酸钠
CH2OH E As-CH=CHCl + CHSH S CH2SH S CH2OH E + CHS As-CH=CHCl SH CH2S SH
（1）在振荡或搅拌速度速度不高时，反应速度随振荡或搅拌速度的增加 而升高，在达到一定水平后不再升高。 （2）若速度过大，可能引起固定化酶的结构破坏，缩短固定化酶的使用 寿命。 （3）底物浓度， pH 值，温度，反应时间等条件可与游离酶活力测定的 条件相同。
例题：
某无细胞的粗提液，每mL含20 mg 蛋白质。在0.5mL的标 准总反应体积中，含有10 L 这中提取液。在最适宜条件下 ，一分钟内生成30ng的产物。求：

(3)酶液与底物溶液在规定状态下混合开始反应。 (4)适时测定产物的生成量或底物的减少量。


终止酶反应的方法
①加热失活：酶反应时间一到立即取出适量的反应液，置
于沸水浴中；

②变性失活：酶反应时间一到立即加入适宜的酶变性剂， 如三氯醋酸等；

③酸碱失活：酶反应时间一到使反应液的 pH 值迅速远离 酶催化反应的最适 pH ，从而终止反应；
④低温失活：酶反应时间一到将取出的反应液立即置于冰 粒堆中或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至 10 ℃ 以下。


固定化酶的活力测定

振荡测定法：称取一定重量的固定化酶，放在一定形状，
一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在特定的条件 下，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应经过一定时间，取 出一定量的反应液进行测定。 注意点：
• 反竞争性抑制的特征曲线： 1 v
[I] 1 (1+ Ki ) Vmax
1 Vmax
[I]
正常
-1 (1+ [I] ) Km Ki
-1 Km
1 [S]
•反竞争性抑制的特点：
1、I与S分子结构不同,I只与ES结合 2、Vmax 和表观Km都减小； 3、抑制程度取决于[I]和[ES]二者的浓度。


3、酶活力测定
包括两个阶段： 反应阶段和测定阶段。
一般采取如下步骤：

(1) 根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。


要求底物均匀一致，具有一定的纯度，新鲜配制。
（ 2 ）确定酶促反应的温度，pH 值等条件。 温度可选酶反应最适温度 pH 值应是酶促反应的最适 pH 值反应条件在反 应过程中应尽量保持恒定不变。
活性降低或丧失。
抑制剂：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白变性的