苯乙烯类菁染料pH荧光探针在细胞荧光成像中的应用及细胞毒性检测黄丽霞;刘香;崔丹婷;许乙凯;游文玮;严轶琛;路新卫;刘瑞源【摘要】目的：制备一种苯乙烯类菁染料用于细胞活体荧光成像。
方法将1,1,2-三甲基-1氢-苯并吲哚和4-吡啶苯甲醛反应得到苯乙烯类菁探针，考察pH对苯乙烯类菁探针荧光性能的影响，检测探针对细胞活性的影响，最后将苯乙烯类菁探针作为探针应用于活细胞成像。
结果制备的苯乙烯类菁探针在中性和碱性条件下显示绿色荧光，在酸性条件下荧光发生由绿色变成橙色。
该探针用于细胞活体成像荧光信号清晰可见。
结论研制出了一种用pH敏感的苯乙烯类菁探针，该探针表现出了较好的细胞穿透性和细胞活体成像性能。
%Objective To prepare a pH fluorescence probe based on styrylcyanine dyes for live cell imaging. Methods The Probe 1 was prepared by reaction of 4-pyridinecarboxaldehyde with 1,1,2-trimethylbenz[e]indole. The influence of pH on the fluorescent properties was examined, and the cell viability was examined using cell counting kit-8. The Probe 1 was used as a pH fluorescence probe in living cell. Results Probe 1 emitted green fluorescence under neutral and basic conditions but orange fluorescence under acid condition. Probe 1 selectively stained the cytoplasmic regions of living cells without significantly affecting the cell viability. Conclusion The pH-sensitive fluorescent probe prepared based on styrylcyanine possesses good ability of cell membrane permeation for live cell fluorescent imaging.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2014(000)011【总页数】4页(P1642-1645)【关键词】苯乙烯类菁;pH荧光探针;细胞成像;细胞毒性【作者】黄丽霞;刘香;崔丹婷;许乙凯;游文玮;严轶琛;路新卫;刘瑞源【作者单位】南方医科大学南方医院影像中心，广东广州 510515;南方医科大学南方医院影像中心，广东广州 510515;南方医科大学南方医院影像中心，广东广州 510515;南方医科大学南方医院影像中心，广东广州 510515;南方医科大学药学院，广东广州 510515;南方医科大学药学院，广东广州 510515;南方医科大学药学院，广东广州 510515;南方医科大学药学院，广东广州 510515【正文语种】中文Abstract：ObjectiveTo prepare a pH fluorescence probe based on styrylcyanine dyes for live cell imaging.MethodsThe Probe 1 was prepared by reaction of 4-pyridinecarboxaldehyde with 1,1,2-trimethylbenz[e]indole.The influence of pH on the fluorescent properties was examined,and the cell viability was examined using cell counting kit-8.The Probe 1 was used as a pH fluorescence probe in livingcell.ResultsProbe 1 emitted green fluorescence under neutral and basic conditions but orange fluorescence under acid condition.Probe 1 selectively stained the cytoplasmic regions of living cells without significantly affecting the cell viability.ConclusionThe pH-sensitivefluorescent probe prepared based on styrylcyanine possesses good ability of cell membrane permeation for live cell fluorescent imaging.Key words：styrylcyanine;pH fluorescent probe;cell imaging;cytotoxicity细胞内pH在细胞增生和凋亡，酶催化活性，离子转运及肌肉收缩等过程中扮演着重要角色［1］。
一般情况下细胞内存在两个较宽的pH范围：pH=6.8～7.4，如细胞质，pH=4.5～6.0，即所谓的酸性细胞器，如溶酶体［2］。
细胞功能紊乱，癌症，老年痴呆症等疾病会导致细胞内pH值偏离正常值［3］。
因此检测细胞内pH变化对研究细胞的生理和病理过程具有重要作用。
近年来发展起来的生物荧光成像技术具有快速无损伤，直观，灵敏度高等特点，已广泛用于监控细胞内pH的变化［4-5］。
菁染料由于具有优良的光学性能，作为荧光探针广泛应用于生物检测和成像中［6-7］。
在水溶液中，吲哚N原子上没有取代基的菁染料可以产生质子化和去质子作用，这种作用改变菁染料的荧光性能而被用于pH荧光检测［8-9］，但未见用于活细胞荧光成像的报道。
苯乙烯类吲哚菁染料具有良好的光稳定性、合适的水溶性及很好的细胞膜通透性,而且在细胞内具有较强的荧光［10］。
这类染料的合成非常简单，收率高。
为此，本文设计合成基于苯乙烯类菁染料的荧光探针，检测pH对其荧光性能的影响，并成功地将其用应用于活细胞荧光成像。
1.1 材料和仪器布鲁克DMX 400 MHz核磁共振仪；岛津FTIR-8100红外光谱仪（KBr压片）；元素分析仪；PTI2C2700 Felix荧光分光光度计（美国PTI公司）。
1 ,1 ,2 -三甲基-1氢-苯并吲哚（百灵威试剂，AR）；4-吡啶苯甲醛（百灵威试剂，AR）；三氟乙酸（百灵威试剂，AR）；N,N-二甲基甲酰胺（DMF），四氢呋喃（THF），无水乙醇，乙酸乙酯和正己烷（金华大试剂，AR）。
试剂均未经进一步纯化而直接使用。
实验用水为二次去离子水。
人宫颈癌细胞株HeLa由南方医院中心实验平台提供；1640培养液和胎牛血清（FBS）购于Hyclone公司，MTT试剂和二甲基亚砜（DMSO）购于Sigma公司。
培养液体积分数为10%的胎牛血清，1%青霉素和链霉素的1640培养基，37℃恒温培养。
1.2 探针的合成在100 ml烧瓶中，加入1,1,2-三甲基-1氢-苯并吲哚（2.09 g，10 mmol），4-吡啶苯甲醛（1.07 g，10 mmol），50 ml无水乙醇和1滴哌啶，加热回流24 h。
旋蒸除去乙醇。
残余物用二氯甲烷作洗脱剂经硅胶柱层析分离纯化，重结晶得到黄色固体1.91 g，收率64%。
1H NMR （400 MHz,DMSO）δ（ppm）=8.65（d,J=4.7,2H）,8.19 （d,J=8.4,1H）,8.04（d,J=8.2,1H）,7.97（d,J=8.5,1H）, 7.82（dd,J=13.2,7.7,4H）,7.69（s,1H）,7.67-7.60（m,1H）,7.52（t,J=7.5,1H）,1.65（s,6H）。
13C NMR（101 MHz,DMSO）δ=184.29,150.74,150.20,143.00,139.83,134.40,132.20,129.46,129.05,128.04,126.75,124.89,123.59,123.05,121.72,120.18,54.22,21.85.IR（v-1,LiBr）:3050,2973,2927,2836,1595,1545,1502,1461,1415,1217,970,823,744.MS（MALDI-TOF）: C21H18N2 m/z 298.1470 for［M］+Na+.321.1362. Elemental Analysis:Calcd C,84.53;H,6.08;N,9.39. Found C,85.04;H,6.11;N,8.85.1.3 荧光检测配制300 mol/L探针的DMSO溶液，备用。
取0.1 ml探针DMSO溶液于10 ml 容量瓶中，加入不同pH水溶液1 ml后，双蒸水稀释至10 ml，检测荧光强度。
测量荧光强度时，激发波长为384 nm，狭缝宽度为1.0 nm/ 1.0 nm。
1.4 细胞培养和成像取对数生长期的HeLa细胞接种于置有6孔板中,培养过夜，换用含有6 mol/ml探针1的1640培养液继续培养HeLa细胞4 h后，采用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗6孔板3次，置于倒置荧光显微镜（IX71倒置显微镜，奥林巴斯）下观察。
探针的激发光为510～550 nm的绿光波段。
1.5 MTT法检测细胞生长活性将HeLa细胞以每孔6×103个细胞接种于96孔板，培养过夜，换用含有探针终浓度分别为1～10 mol/ml的培养液，每孔200 L继续培养24 h后，吸弃上清液，每孔加入10 L MTT试剂（5 mg/ml，用PBS配制），继续培养4 h。
弃去培养液，每孔加入150 L DMSO，置于细胞摇床中10 min，至蓝色颗粒完全溶解，转移至酶标仪（ELX800全自动酶标仪，美国宝特仪器有限公司）490 nm处测定各孔吸光度值，以含有细胞的培养液和MTT为对照组，以只加等量的培养液和MTT 为空白孔。
按照此公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（实验孔吸光度值-空白孔吸光度值）/（对照孔吸光度值-空白孔吸光度值）×100%。