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5 5 自 ,99- 年人类胚胎干细胞 （ 3<=%# "=>?@A#BC DE"= C"FF ， 3)*2 ） 建系以来
［,， ;］
点杂交 技 术， 比 较 3)*2 和 43)*2 的 基 因 表 达 差 异， 筛选出代表 在 3)*2 中 高 表 达、 在 43)*2 中 低 表达或不表达基因的 )*+ ， 从而为进一步分离与维 持 3)*2 未 分 化 状 态 相 关 的 新 基 因、 阐明维持 3)*2 未分化状态的机制打下基础。
! 遗 传 学 报 ! !"#$ %&’&#("$ )(’("$ ， "#$%#&’#( )**+ ，,- （ . ） ：./0 1 .0)
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， 3)*2 迅 速 成 为 生
命科学研究的热点， 而如何在体外培养过程中维持 3)*2 的未分化 状 态 亦 成 为 其 中 的 核 心 问 题 之 一。 对小鼠 )*2 （ =A<D" )*2 ， =)*2 ） 的研究已经发现 了 一 些 与 之 相 关 的 因 子： 一是白血病抑制因子 （ G"<&"=B% B#3B>BEA?@ H%CEA? ， GIJ ） 介导的信号转导 通路。体外培养时在无滋养细胞层时添加 GIJ 因子 足以维持 )* 细胞的未分化 状态［ 8 ］。 研究 表 明， GIJ 主要通过 诱 导 激 活 K%&0*E%E8 信 号 通 路 起 作 用［ : ］； 另一个是参与 )* 细胞自我复制 和增 殖 过程 的 转 录 因子 LCE0:［ . ］。 LCE0: 在卵裂球、 原始内胚 层 等 多能 性组织中表达， 提 示 LCE0: 与 这 些 组 织 细 胞 发 育 的 多能性有关。 LCE0: 在 )* 细胞中表 达， 但 )* 细 胞 分化 时 LCE0: 的 表 达 迅 速 下 降 而 消 失， 说 明 LCE0: 与 )* 细胞维 持 自 我 复 制 和 未 分 化 状 态 密 切 相 关。 LCE0: 能与靶基因的启 动 子 或 增 强 子 结 合 从 而 激 活 或抑制靶基因 的 表 达， 但 LCE0: 的 具 体 作 用 机 理 及 靶基 因 的 生 物 学 意 义 还 不 是 很 清 楚。 最 近 发 现， M%#AN 基因亦与维持 )*2 的未分 化状 态 相 关
［(， ’］
,5 材料和方法
!" !# 材 # 料 人类胚胎干细胞 3)*2, 细 胞 系 和 分 化 细 胞 克 隆 43)*2, 为 本 研 究 所 建 立 培 养 和 收 集 （另文发 表） 。 /M6 IDAF%EBA# UBE 购 自 !"#E?% 公 司； =/M6 VB#B UBE 购 自 WI6!)M 公 司； *=%?E CTM6 *@#E3"0 DBD *@DE"= UBE 、 12/0*"F"CE +V CTM6 *<>E?%CEBA# UBE 、)XP?"DDR@> 杂 交 液 均 购 自 2FA#E"C3 公 司； 1?B="?0%0!"#" G%>"FB#N *@DE"= 购 自 1?A="N% 公 司； /"Q"?E6B4 JB?DE *E?%#4 CTM6 *@#E3"DBD UBE 购 自 J"?="#E%D 公 司。 4M+1 、 普 通 !"# 酶 及 琼 脂 糖 等试剂均购自上海生工。 !" $# %&’( 提取 收集 3)*2, 及 43)*2, 细胞至 , Y ,7 . 左 右。 按照 /M6 IDAF%EBA# UBE 的 操 作 说 明 提 取 细 胞 的 总 /M6 。用 =/M6 VB#B UBE 从 总 /M6 中 提 取 =/0 M6 ， 以 ,7 ! G 洗脱液溶解 =/M6 并定量。 !" )# 双链 *+’( 合成 按 *=%?E CTM6 *@#E3"DBD *@DE"= UBE 提 供 的 方法合成 CTM6 第 , 条链。取 8 ! G =/M6 （ 约 7Z ; 模 板， 与 , ! G *V6/+ " 6 AFBNA#<CF"AEB4（ ,7 !N ） ! =AF [ G ）和 , ! G *V6/+ 2T* P?B="? " 6 （ ,7 ’7\ ; =B# 。 然 后 加 入 ; ! G . Y ! =AF [ G ）混 合， JB?DE0DE%#4 ><HH"? 及 , ! G T++ （ ;7 ==AF [ G ） ， , !G 4M+1 （ ,7 ==AF [ G ）及 , ! G 1A]"?*?BPE /"Q"?D" +?%#DC?BPE%D" ， 于 :;\ 反应 , 3 。取 , ! G 合 成 的 单 链 CTM6 ， 加入 ,7 ! G ,7 Y 64Q%#E%N" ; 12/ ><HH0 "? 、 , ! G 4M+1 （ ,7 ==AF [ G ） 、 ; ! G .^12/ P?B="? "
收稿日期： )**, 5 -* 5 -, ； 修回日期： )**+ 5 *) 5 -* 基金项目： 国家自然科学基金重点项目 （ 编号： ,**,**4* ） ， 国家 重 点 基 础 研 究 发 展 规 划 （ .4, ） 项目 （ 编 号： **-67/-*-* ） 资助 ［ "8$$9(%#: ’; ,**,**4* ） @>:‘ .4, ’$(9G(@&? （ 39H **-67/-*-* ） ］ 6<=>#?# 3@%=9>@A 3@%8(@A "B=#>B# C98>:@%=9> D@E9( F(9G(@&（ 39 ： 作者简介： 杜! 娟 （ -.0. 5 ） ， 女， 助理研究员， 博士， 研究方向： 人胚胎干细胞维持未分化状态机制。 IJ&@=A ：%@>:8E8@>K?=>@H B9& IJ&@=A ： AGL:=(#B%9(K?=>@H B9& ； M#A ： *4,- 5 +N*/,-. ! ! 通讯作者。 万方数据
T_ K<%# $% "&’ ： *C?""#B#N AH TBHH"?"#EB%F !"#"D $"E]""# R<=%# )=>?@A#BC … 个。通过与 !"#$%#& 比较， 显示其中 ’( 个 )*+ 代表 (, 个已知基 因， ,- 个 )*+ 代 表 ,. 个 假 想 基 因， 另 有 ,, 个 属 于未知 )*+ 。选取其中 - 个克隆进行半定量 /+012/ 分析， 证实其中 ’ 个克隆在 3)*2 中高表达， 在 43)*2 中 低表达或不表达。结果表明， 3)*2 分 化 前 后 涉 及 多 个 基 因 的 差 异 表 达， 对 这 些 在 3)*2 中 高 表 达、 在 43)*2 中 低表达或不表达基因的进一步功能研究为阐明维持 3)*2 未分化状态的机制提供了基础。 关键词：人类胚胎干细胞 （ 3)*2 ） ；抑制消减杂交；差异表达基因；未分化状态 中图分类号： 5 5 5 文献标识码： 65 5 5 文章编号：78’9 0:,’; （ ;77: ） 79 079.( 07’
（ *’+#(#,#& -. /&01-2,"#(-’ $’2 )#&3 4&55 6’7(’&&1(’7 ， 48$’7+8$ ! +-**4N ， 48(’$ ）
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