胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景【摘要】胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞)主要来自于胚胎发育早期囊胚中内细胞群(inner cell mass, ICM), 具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性。

理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞，可作为细胞移植、组织替代, 甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多难治性疾病提供细胞来源。

本文简述了胚胎干细胞的诱导分化方法、定向分化的一些细胞种类以及应用前景。

【关键词】胚胎干细胞；诱导；分化ES细胞是由囊胚的内细胞群或胎儿的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外抑制分化培养而获得的一种具有多向分化潜能的细胞。

英国剑桥大学的Evans等[1]于1981年首次建立了小鼠胚胎干细胞系。

Thomson等[2]于1998年利用临床上体外受精的胚胎，采用免疫法分离出内细胞群，首次成功分离出人胚胎干细胞系。

同年，Sham blott等[2]以STO作为饲养层首次建立了人胚胎生殖细胞(hEGC)系。

一般情况下，可将胚胎干细胞和胚胎生殖细胞统称为胚胎干细胞。

饲养层或白血病抑制因子（LIF）是ES细胞体外培养过程中保持未分化状态的必要条件。

当培养条件有轻微改变时，例如在培养液中添加某些诱导分化因子（维甲酸RA、DMSO等），ES细胞就会发生分化；另外，如果把脱离饲养层的ES细胞进行悬浮培养，会发育成大小不一的拟胚体（embryoid boby, EB）,然后可诱导EB向不同类型细胞分化。

至今，已从ES细胞诱导分化出心肌细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞、造血细胞、脂肪细胞、胰岛素细胞、神经细胞、内皮细胞等。

这些诱导后的细胞有望为器官移植、损伤器官的修复提供原材料，具有十分广阔的临床应用前景。

所以，近年来有关胚胎干细胞的定向分化研究已成为全世界研究的热点。

1诱导ES细胞定向分化的方法目前，通常针对人们设想要得到的终末靶细胞，而采用不同的诱导分化方法，使ES细胞最终定向分化为目的细胞。

最常用的诱导方法一般包括以下四种：化学试剂诱导法、细胞因子诱导法、共培养诱导法以及转基因诱导法等。

1.1化学试剂诱导法维甲酸（retinoic acid，RA）是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。

Schuldiner等[3]用一定浓度的RA（10-6M）诱导人ES细胞向神经细胞分化。

实验证实：产生的神经细胞比未用RA处理的对照组增加了22%。

目前，RA诱导ES细胞分化为神经细胞的机制还没有完全弄清楚。

一般认为RA进入细胞后，最先与细胞质中维甲酸结合蛋白(cellular RA binding protein，CRABP)形成复合物，然后复合物进入细胞核内，与染色质上的受体结合，从而调控一系列基因的表达，使细胞的表型发生转变。

二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫的有机化合物，不仅能用于细胞的常规冻存，而且还是一种常用的细胞分化诱导剂，能够诱导ES细胞分化为骨骼肌细胞、心肌细胞等，其作用机制主要是影响c-myc基因表达，降低细胞的内源性聚腺苷二磷酸核苷表达水平。

也有研究证明，DMSO能使细胞内储存的钙释放出来，而细胞内钙离子浓度升高在诱导细胞分化中可能起着重要作用。

除了RA、DMSO外，还有β-磷酸甘油、维生素C(VC)、地塞米松、维生素K3(VK3)以及2，5-羟基维生素D3等化学试剂，也能诱导ES细胞定向分化为特定类型细胞。

1.2细胞因子诱导法ES细胞在培养过程中对许多细胞因子具有很强的依赖性。

增加或撤销一种或几种细胞因子可影响ES细胞的增殖或分化。

目前研究最深入的细胞因子主要有骨形成蛋白(BMPs)和成纤维细胞生长因子(FGF)等。

Li等[4]实验证实：BMP-4诱导猴ES细胞分化产生的造血前体细胞集落的数目比未添加的对照组升高了17倍。

FGF-2诱导的信号转导为正常细胞生长发育所必需的，参与骨骼形成、血管再生、胚胎发育等生理过程。

有实验证明FGF-2处理ES细胞后，致使核内2种转录因子（Nkx2.5、d-Hand）表达增强，促进ES细胞向心肌细胞分化。

1.3转基因方法诱导ES细胞分化细胞因子法的优点是操作简便，但其诱导产生的目的细胞数量太少，并且纯度不高。

而转基因法可以弥补细胞因子法的不足，其原理是使某个促分化基因在ES细胞中过度表达，从而调控ES细胞的分化。

应用此方法之前，首先要确定决定该细胞向不同方向分化的关键基因，其次还要确保在正确的时间将此基因插入到ES细胞基因组正确序列上。

Prelle等[5]发现胰岛素生长因子II（insulin growth factor II , IGF II）促进小鼠ES细胞向骨骼肌细胞分化时，超表达IGF II基因的ES细胞与未超表达IGF II基因的ES细胞相比，前者在早期阶段有高水平的骨骼肌特异基因表达（myf5、myoD、myogenin）。

目前许多研究都已证明此方法可使ES细胞定向分化为胰腺细胞、神经细胞、肌细胞等。

1.4共培养诱导法近年来，越来越多的实验研究认为共培养诱导法在ES细胞向各种目的细胞分化过程中具有十分重要的作用。

应用与目的细胞共培养诱导ES细胞向肝细胞、脂肪细胞等成功分化的报道屡见不鲜。

Mummery等[6]将ES细胞和小鼠内胚层样细胞（END-2）共培养10天，共培养的ES细胞出现节律性收缩，并且还表达了一些心肌细胞特异性蛋白。

此实验说明，小鼠内胚层样细胞可能为ES细胞向心肌细胞分化提供了特定的生长因子或微环境，从而促进了ES细胞向目的细胞的分化。

2诱导分化后的细胞类型2.1心肌细胞在特定条件下，ES细胞可定向分化为具有节律性收缩的心肌细胞。

这就为研究心脏基因表达和功能提供了较好的体外模型。

王治等[7]发现神经调节蛋白1诱导心肌细胞分化率显著高于自发心肌分化率，并且神经调节蛋白1呈剂量依赖性上调GATA-4、Nkx2.5mRNA表达。

李卫东[8]等的研究结果显示，心肌细胞可诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞定向分化，诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的拟胚体出现，并表达心肌细胞特异性蛋白cTnT、β-actin。

3.2相关问题胚胎干细胞的诱导分化研究有着极其广阔的应用前景，但还有许多急需解决的问题：ES细胞定向分化的条件和机制还没有完全弄清楚。

另外，ES细胞在培养过程中需要饲养层的存在，因此需要寻找一种行之有效的分类、纯化ES细胞的方法；人ES细胞进行移植治疗前应避免其在体内形成畸胎瘤；ES细胞能定向诱导为特定细胞甚至简单的组织，但是要使其发育为像心脏、肾脏这样复杂的器官，以及最后移植到人体内还存在许多技术上的困难；由ES细胞分化而来的外来器官移植到病人体内后，也会存在不同程度的排斥反应。

如何抑制排斥反应是目前的一大难题；ES细胞的研究还会涉及到社会、伦理、法律和道德等一系列问题。

总之，ES细胞的定向分化研究是一项意义重大的科研课题，至今有关ES 细胞定向分化的条件和机制还没有完全弄清楚，ES细胞最终应用于临床的路途还很遥远。

但是，我们始终认为，随着科学技术的飞速发展和人类的进步，在全球科学家的不懈努力下，ES细胞定向分化的难题一定能够被攻克，ES细胞也一定能够在临床上得到广泛应用。

【参考文献】［１］Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature,1981,292:154-156．［２］Thomson JA, Itskovitz EJ, Shapiro SS, et al.Embronic stem cell lines derived from human blastocysts.Science,1998,282:1145-1147．［３］Schuldiner M, Yanuka O, Itskovitz-Eldor J, et al. Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(21):11307-11312.［４］Li F, Lu S J, Vida L, et al. Bone morphogenetic protein induces efficienthematopoietic differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in vitro [J].Blood,2001, 98(2):335-342.［５］Prelle K, Wobus A M, Krebs O, et al. Over expression of insulin-like growth factor-II in mouse embryonic stem cells promotes myogenic differentiation[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,277(3):631-638.［６］Mummery C, Ward-van OD, Doevendans P, et a1.Differentiation of human embryonic stem cells to cardio myocytes: role of co-culture with visceral endoderm-1ike cells [J]. Circulation, 2003,107:2733-2740.［７］王治，黄进.神经调节蛋白1诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化及其机制探讨[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(32):5957-5961．［８］李卫东，张晓刚，等．与心肌细胞共培养的小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞分化[J].基础医学与临床，2009,29（1）:33-37．［９］Wichterle H, Lieberam I , Porter J A , et al . Directed differentiation of embryonic stem cell into motor neurons. Cell,2002,110(3):385－397．［１０］Pachernik J, Bryja V, Esner M, et al. Neural differentiation of Pluripotent mouse embryonal carcinoma cells by retinoic acid: inhibitory effect of serum. Physiol Res, 2005,54(1):115-122．［１１］Dinsmore J, Ratliff J, Deacon T, Pakzaban P, Jacoby D, Galpern W, Isacson O. Embryonic stem cells differentiated in vitro as a novel source of cells for transplantation. Cell Transplant,1996,5(2):131－143．［１２］Zhang SC, Wernig M, Duncan ID, et al. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol,2001，19:1129-1133．［１３］Palacios R, Golunski E, amaridis J, et al. In vitro generation of hematopoietic stem cells from an embryonic stem cell line[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(16):7530-7534.。